免疫组化成功的经验和失败的教训汇总.doc

免疫组化成功的经验和失败的教训汇总 本人最近已做石蜡切片的免疫组化多次，多是成功的，但也遇到许多预想不到的结果和现象，现汇总问题如下，望高手们参与讨论，给出正确的、完整的、权威答案。同时也希望大家补充问题，共同交流经验、体会、感悟。 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？ 2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？ 3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？ 4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？ 5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？ 6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。 7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？ 8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？ 9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？ 10. DAB显色时间到底多少为最佳？一定要是3~10分钟吗？ 11. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？ 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 相关链接： 【整理】免疫组化技术资料大全（原理、步骤、注意事项、教程及常见问题解答） /bbs/post/view?bid=68idty=1tpg=1age=0 【整理】免疫荧光组织（细胞）化学和免疫胶体金技术大全（原理、试剂和器材、操作流程、常见问题及其解决方法） /bbs/post/view?bid=68idty=1tpg=1age=0 【原创】免疫组化技术常见问题及其解答集锦 /bbs/post/view?bid=161idty=1 针对问题2着色不均匀： 1. 脱蜡不充分。可以60度烤20min，立即放入新鲜的xylene1－2； 2. 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； 3. 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； 4. 抗体孵育时，切片放倾斜； 5. 抗体孵育后PBS冲洗不充分。 6. 制片厚薄不均匀等问题。 针对问题5：一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？ 1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片； 2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。 3. 其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！针对问题5：一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？ 1. 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片； 2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。 3. 其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！针对问题2： DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？ 组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后，仔细看一遍，是否有的组织未被试剂完全覆盖，如有这种情况，建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖。另外，染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题，只要留心或想到了很容易发现，也很容易解决。有时，用DAKO（或PAP）笔在组织周围画圈时，划线太靠近或画到了组织上，由于笔油的力学原理，试剂不能达到靠近划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻，有气泡时用牙签捅破。针对问题4：切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？ 全片着色 全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有： （1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。 （2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏