【2017年整理】流式细胞术样品制备技术.doc

流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：① 取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；② 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③ 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④ 再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤ 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节 样本单细胞悬液的制备方法 一 新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 （一） 酶消化法 1 作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有3方面：① 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；② 可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项： ① 酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③ 要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④ 要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3 方法学程序 （1） 将适合于酶消化的组织置于离心管中； （2） 将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中； （3） 一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打； （4） 终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片； （5） 将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。 （二） 机械法 机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。 1 剪碎法： ① 将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水； 用剪刀将组织剪至匀浆状； ③ 加入10ml生理盐水； ④ 用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中； ⑤ 离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离心沉淀去除细胞碎片； ⑥ 以300目尼龙网滤去细胞团块； ⑦ 细胞用固定液固定或低温保存备用。 2 网搓法 ① 将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上； ② 把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完； ③ 收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟； ④ 固定细胞或低温保存备用。 3 研磨法 准备一只70ml研磨器。 ① 先将组织剪成1-2mm3大小组织块； ② 放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水； ③ 转动研棒，研至匀浆； ④ 加入10ml生理盐水，冲洗研磨器； ⑤ 收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀； ⑥ 固定或低温保存细胞悬液，备用。 （三） 化学处理法 1 作用原理 化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。 2 试剂的配制 ① 0.2%EDTA配制：EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4℃保存； ② 胰酶加EDTA配制：