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流式细胞术样品制备技术
流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上,这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中,制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞,又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤:① 取材:取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织,必须取瘤细胞生长旺盛部位;组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜;一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存;② 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色;③ 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储;④ 再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析;⑤ 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节 样本单细胞悬液的制备方法
一 新鲜实体组织样本的制备
FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上,根据各种组织成分的特点,可选择不同的分散细胞方法,以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序,但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中,解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以,在对各种不同组织进行分散选择方法时,应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
(一) 酶消化法
1 作用原理:
对实体组织分散的作用原理主要有3方面:① 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等;② 可以水解组织间的粘多糖等物质;③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有:蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等,都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键;胶原酶能降解几种分子类型的胶原;溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键;弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用,可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2 注意事项:
① 酶需要溶解于适当的溶液中,而这些溶液不致于造成酶效价降低;②要注意酶的使用浓度和消化时间;③ 要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性,胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等;④ 要随时注意影响酶活性的其它因素,如酶的生产批号等。
3 方法学程序
(1) 将适合于酶消化的组织置于离心管中;
(2) 将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中;
(3) 一般消化20-30分钟(恒温37℃或室温),消化期间要间断振荡或吹打;
(4) 终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞团块,以低速成离心除去细胞碎片;
(5) 将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测,或保存备用。
(二) 机械法
机械法分散实体组织包括:用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织,用匀浆器匀浆,再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液;采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块,所以机械法常与其它方法配合使用。
1 剪碎法:
① 将组织块放入平皿中,加入少量生理盐水;
用剪刀将组织剪至匀浆状;
③ 加入10ml生理盐水;
④ 用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管中;
⑤ 离心沉淀1000prm,3-5min,再用生理盐水洗3遍,每次以低速(500-800prm)短时离心沉淀去除细胞碎片;
⑥ 以300目尼龙网滤去细胞团块;
⑦ 细胞用固定液固定或低温保存备用。
2 网搓法
① 将100目,300目尼龙网扎在小烧杯上;
② 把剪碎的的组织放在网上,以眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边加生理盐水冲洗,直到将组织搓完;
③ 收集细胞悬液,离心沉淀500-800prm,2分钟;
④ 固定细胞或低温保存备用。
3 研磨法
准备一只70ml研磨器。
① 先将组织剪成1-2mm3大小组织块;
② 放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水;
③ 转动研棒,研至匀浆;
④ 加入10ml生理盐水,冲洗研磨器;
⑤ 收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀500-800 prm,1-2 min,再以生理盐水洗3 遍,离心沉淀;
⑥ 固定或低温保存细胞悬液,备用。
(三) 化学处理法
1 作用原理
化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来,从而使细胞分散开来。
2 试剂的配制
① 0.2%EDTA配制:EDTA 0.2g,加入Hankˊs液100ml,封装高压消毒。置0℃-4℃保存;
② 胰酶加EDTA配制:
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