分子生物学实验讲义2014版加图版.doc

25 分子生物学实验 中南民族大学 生命科学学院 2011年9月 实验一 植物总DNA的提取和酶切 一、 实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。 二、 实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、 实验材料 水稻幼叶 四、 主要器材 水浴锅，微量移液器，枪头，离心管，台式离心机，恒温箱，标签纸，磁力搅拌机，剪刀等。 五、 主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4 g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml (pH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可； NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)，EcoRI 内切酶（TaKaRa），酶解缓冲液方法 （2）取少量叶片（约g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； 加入700ul的，轻轻搅动； 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； 5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，0 min后取出； 6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）， min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，入另一新的灭菌离心管中氯仿-异戊醇； （8）10 000 rpm离心1 min后，轻轻地吸取上清，转入另一新的灭菌离心管异丙醇，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入l的75%乙醇，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入l的乙醇，将DNA再洗 min； （13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； （14）加入50 μl 0.5 × TE(RNase)缓冲液，使DNA溶解置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；（15）（1）置于-20℃保存、备用。 μl，其中包括： 10 × 酶切缓冲液 5 μl PCR纯化产物 0.5~1.0 μg EcoRI 1 μl PstI 1 μl 无菌双蒸水 补至50 μl 混匀酶切反应物后，于37℃下酶切3 h或过夜。 七、 注意事项 采用剪口的枪头轻轻吸取上层水相时，注意不要吸到蛋白层。 八、 思考题 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA 实验二 动物组织（）RNA的提取实验目的：使学生掌握采用Trizol抽提法从动物新鲜组织或细胞制备总RNA的实验技术，以及用紫外分光光度法检测RNA的纯度及定量、用琼脂糖电泳法检测RNA的完整性及质量。、实验原理： Trizol是一种新型的总RNA即用型制备试剂，适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。Trizol 试剂是由苯酚和异硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。但酚虽可有效的变性蛋白质，却不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇