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实时荧光PCR检测鼠源性成分的定性方法验证

随着生活质量的不断提升，人们对优质肉类及产品的需求逐年上升。然而，仅通过肉眼观察难以分辨各类肉质的好坏[1-2]，一些经营者为牟取暴利，采取掺杂低廉肉品、注胶注水等手段，严重影响了食品安全[3-5]。鼠肉价格低廉，通常是不法商家的首选。然而，鼠肉携带多种病菌，含铅、砷等有毒有害物质较高，食用后会对人类健康造成严重危害，并增加疫病传播风险[5]。因此，对肉类及其制品中鼠源性成分的检测，是保障食品安全的重要环节[6]。对于鼠源性成分的检测方法，目前国内标准主要有GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》和BJS201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法》[7-8]。

本研究旨在验证GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》在肉类食品中鼠源性成分检测上的适用性，并将其与其他鼠源成分PCR鉴定方法进行对比，以提供肉类掺假鉴别的方法依据和技术支撑。

1材料与方法

1.1实验材料

本次实验所用鼠DNA样品分别来自：1号鼠DNA样品由中国检验检疫科学研究院馈赠（褐家鼠）；2号鼠DNA样品由南京市食品药品监督检验院馈赠（Balb/c小鼠）。小家鼠新鲜组织样本由本实验采购。

1.2仪器与试剂

①仪器：荧光定量PCR仪（CFX-96，BIORAD，美国），紫外分光光度计（SHIMADZU)；Dneasymericon食物核酸提取试剂盒（QIAGEN，德国）。②试剂：鼠种特异性基因测定试剂盒（荧光PCR法，北京良润）；TaKaRaTaqmanRealTimePCR预混液（日本TAKARA公司）；引物与荧光探针均由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.3样本处理及总DNA提取

生鲜肉组织用灭菌水进行简单冲洗，称取适量样品，并使用组织研磨仪进行研磨。采用离心柱型Dneasymericon食物核酸提取试剂盒，按照说明书操作，提取200mg肉制品中的总DNA，并命名为3号鼠。

1.4引物和探针

分别依据标准GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》、BJS201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法》合成鼠成分荧光PCR检测相应的引物及探针，序列见表1。

表1引物探针序列表

1.5有效性实验

根据GB/T38164—2019的实验方法，以3号鼠的DNA为模板，使用GBT引物和探针进行PCR扩增，以评价国标方法的有效性。PCR反应体系如下：DNA模板2μL（浓度为50ng·μL-1），引物GBT鼠-F/GBT鼠-R和探针GBT鼠-P各1μL，2×PremixExTaq12.5μL，灭菌双蒸水补足至25μL。PCR扩增条件分别为：95℃、30s；95℃、5s；62℃、40s，共40个循环，在62℃时，采集荧光信号。

1.6对比实验

根据BJS201904《食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法》，以及鼠种特异性实时荧光PCR检测试剂盒的实验方法，以3号鼠DNA为模板，进行相应的荧光PCR扩增。通过对比2种方法的扩增曲线和Ct值，评估GB/T38164—2019方法的特异性。BJS201904方法使用BJS引物和探针进行PCR扩增，除了反应退火温度和时间外，PCR反应体系和扩增条件与步骤1.6相同。试剂盒的荧光PCR反应体系及扩增条件，按照试剂盒说明书进行操作。

1.7温度梯度实验

根据GB/T38164—2019实验方法，以3号鼠DNA为模板进行实验。为了分析不同退火温度对实验结果的影响，本研究设置了6种不同的退火温度。除了退火温度不同外，PCR反应体系和扩增条件与步骤1.6相同。

1.8适用性评估实验

根据GB/T38164—2019实验方法，分别以1号鼠、2号鼠和3号鼠的DNA为模板，使用GBT引物和探针进行PCR扩增，以评估国标方法在检测不同鼠源性成分上的局限性。PCR反应体系和扩增条件与步骤1.6相同。

2结果与分析

2.1有效性实验结果

根据GB/T38164—2019的实验方法，以3号鼠的DNA为模板，使用GBT引物和探针进行PCR扩增，扩增结果见图1。从结果可知，GBT引物和探针对目标基因无明显的特异性扩增曲线，说明GB/T38164—2019标准中的引物探针不具有良好的物种特异性，不适用于小鼠物种的鉴别。

图13号鼠成分扩增曲线图

2.2对比实验结果

分别用BJS引物和探针及商品化的鼠源特异性PCR试剂盒对3号鼠DNA进行荧