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ASPP家族蛋白表达质粒的构建及其在ROS诱导的HepG2细胞凋亡中的角色的中期报告 本研究旨在构建ASPP家族蛋白表达质粒，并探究其在ROS诱导的HepG2细胞凋亡中的作用。该研究已经完成了表达质粒的构建和验证，现进入实验室操作和数据分析阶段。 一、表达质粒的构建 1.1 PCR 我们首先使用ASPP1、ASPP2和iASPP的基因组DNA序列，利用引物，进行PCR扩增。PCR的产物用琼脂糖凝胶电泳检测后，进行纯化。 1.2 克隆 将PCR产物克隆入pGEM-Teasy向量中，并进行测序验证，确认序列无误后，将其切入pIRES2-EGFP质粒中。 1.3 测序 利用Sanger测序仪对表达质粒进行测序，并与原始序列进行比对，确认表达质粒的正确性。 二、实验室操作 在HepG2细胞中，通过添加H2O2诱导ROS的产生，观察ASPP家族蛋白的表达对细胞凋亡的影响。 2.1 细胞培养 使用HepG2细胞系，培养至稳定生长状态。将细胞接种在6孔板上，分为对照组、空质粒组、ASPP1组、ASPP2组和iASPP组。 2.2 转染 将表达质粒分别转化入细胞中，使用荧光显微镜观察转染效果。 2.3 H2O2诱导 在细胞培养基中加入不同浓度的H2O2，诱导细胞内ROS的产生。 2.4 总蛋白提取 使用RIPA缓冲液，将细胞从6孔板中剥离，收集于离心管中，并用超声波破碎蛋白质。 2.5 Western blot 通过Western blot技术检测ASPP家族蛋白的表达情况，并对其进行半定量分析。 三、预期结果 我们预期通过该研究，可以构建ASPP家族蛋白表达质粒，并探究其在ROS诱导的HepG2细胞凋亡中的作用。具体来说，我们希望能够证明ASPP家族蛋白对ROS诱导的细胞凋亡有一定的抑制作用，从而为深入研究ASPP家族蛋白的作用机制提供基础数据和新的研究思路。