负染技术、扫描电镜样品制备技术.ppt

负染技术阴性反差染色，染色剂不被样品吸收而是沉淀到样品四周。用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞成份的检测。染色液的特点不和样品发生反应可保护样品结构可提供足够高的反差本身颗粒体积很小2-4%磷钨酸，；2-3%醋酸铀，pH4.20102（二）操作方法被检样品纯度和浓度2.染色液pH3.操作技巧待检生物组织悬液滴于载网，静置5-10min滤纸吸去载网边缘多余液体网未完全干染色液，染色3-5min?(三)影响因素扫描电镜生物样品制备技术含水量少的组织(骨骼、牙齿、毛发等)预处理、导电含水量多的组织(大多数组织)预处理、干燥、导电样品预处理常规样品取材5×8mm，保护观察面清洗漂洗、冲洗、擦洗，快！固定、脱水同超薄切片单击添加大标题单击此处添加大标题内容膜未干游离细胞收集所需细胞适量0.1%多聚赖氨酸PBS洗涤，1000rpm5min,弃上清4×6mm玻片,室温5-10min滴入2-4ml0.5%戊二醛，4oC0.5h吸去多余液体,成膜PBS洗涤，1000rpm5min,弃上清，制成悬液细胞悬液滴于玻片，5-30min滤纸吸去多余液体1%戊二醛，4oC1hPBS漂洗，1%OsO4，4oC1h，梯度酒精脱水（三）欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部用“割断法”暴露观察部位1.常用的割断法二甲基亚砜(DMSO)割断法环氧树脂割断法2.冷冻割断的操作TF-1冷冻割断仪简易割断器注入液氮固化包埋割断溶化冲洗标本制作法取材(1×1×5mm)、前固定(1%OsO4，4oC1h)浸洗(0.1MPBS，10min×3次)DMSO浸泡(12.5%、25%、50%各30min)冷冻割断后固定(0。1%OsO4，4oC30min)双蒸水洗涤30min，2%单宁酸15min×2次，双蒸水洗涤30min1%OsO4，4oC30min，双蒸水洗涤30min梯度酒精脱水单击此处添加大标题内容除去脱水剂使组织真正干燥，克服表面张力的影响，保存样品表面微细结构二生物样品的干燥01无法避免表面张力的影响，仅用于含水较少的样品1.自然干燥法02样品以液氮快速冷冻移至真空冰升华为汽费时低温损伤2.冷冻干燥法033.坎烯干燥法升华介质——坎烯45oC以下为固态，室温中可升华标本预处理1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min纯坎烯45oC20min室温，坎烯变为固体，放入真空、升华4.乙腈干燥法标本预处理50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min(用乙醇配制)立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华临界点干燥法干燥效果最好，应用最广泛原理物质三相(固、液、气)相互转化，可单相存在，也可复相存在。临界状态：物质在特定温度(临界温度)时，表面张力系数为零，物质不以液态存在，变成气体。液态CO2临界温度：31.5oC，临界压力72.8kg/cm2单击此处添加小标题样品固定、脱水中间液(醋酸异戊酯)置换样品置入预冷的样品室注入液态CO2CO2置换临界处理放气取样单击此处添加小标题方法