扫描电镜及其制样技术.ppt

取样部位要准确。01取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。03取样大小要适当：常为≤1cm3。02样品的基底部应切割平整（以便于样品粘贴），观察面应作好识别标记。04取样清洗2、清洗（1）清洗的目的：充分暴露样品观察面的表面特征。（2）清洗液的选择常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液；特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织等）的初级清洗。（3）清洗的方法浸泡清洗。震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜等），可利用震荡器进行震荡清洗。离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。（4）清洗的要求样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净，以充分暴露表面特征。固定3、固定（1）固定的目的保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状态。使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表面张力变化的能力。提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。（2）常用的固定剂戊二醛：常用浓度为1~4%。锇酸：一般用1~2%浓度。（3）固定的方法先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清洗后，再用锇酸固定30~60分钟。脱水脱水的目的用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使样品在后续干燥处理时的表面张力减少。表1几种液体的表面张力单位：达因/cm液体乙醇丙酮水表面张力16.49（20℃）21.16（40℃）70.61(20℃）02脱水的方法PBS清洗3次，5~10min/次→乙醇梯度脱水到纯乙醇，5~30min/级。脱水的要求脱水要彻底；严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品的皱缩、塌陷或变形。01干燥燥，以保护镜筒高真空和样品不变形。干燥的目的彻底去除样品中的脱水剂，使样品干01020403空气干燥法真空干燥法冷冻干燥法临界点干燥法DCAB（2）干燥的方法干燥的方法空气干燥法方法：把样品放在空气中，让其中的脱水剂自然挥发掉，以达到干燥的目的。特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许多样品发生变形或收缩，故本法是在缺乏其他条件下不得已采用的干燥方法。干燥的方法真空干燥法方法：在真空的条件下使样品中的脱水剂挥发掉。特点：效果与空气干燥时相同，仅是干燥的速度较快。12干燥的方法冷冻干燥法特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面，所以由表面张力引起的样品变形和损伤大为减少，因此干燥效果较好。缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。图3-1冷冻干燥法技术流程胃粘液腺癌培养细胞的表面扫描电镜图象。①细胞膜向外形成许多微绒毛。②细胞分裂中期：细胞中央突出部为纺锤体一端之中心粒部，其四周为形成赤道板的染色体③细胞分裂后期：两个子细胞的核(N)正在形成,分别位于两端并向外膨出。④细胞分裂末期：两个细胞已将完全分开,很少胞质相连。该二细胞深面为一分裂间期的贴壁细胞表面图象。①人胃粘膜表面：衬有单层柱状上皮细胞，且被纵横交错的小沟分隔许多小区（胃区），分布着许多胃小凹（F）。②人胃小凹：局部放大，可见胃上皮细胞顶端之间有一定的距离，并有棵粒状分泌物从细胞间排出③人胃粘膜上皮细胞：表面粗糙不平，布满短小的微绒毛。①兔肺细支管黏膜表面：假复层柱状纤毛上皮，顶部伸出纤毛。其间夹有较多杯状细胞，表面布满短小微绒毛。②图①的局部放大：图中部为2个杯状细胞，周围布满由纤毛细胞伸出的大量纤毛。兔气管粘膜表面：在密集的纤毛丛中有一杯状细胞(G).该细胞顶端彭大,表面有长短不一的微绒毛。子宫内膜：无纤毛细胞分泌物外排的另一种方式，即在细胞顶端的质膜表面，以微绒毛为基础，扩展成泡状隆起，分泌物自泡内排出后，质膜塌陷回缩，进而恢复原状。图左上为纤毛细胞。a：填充液体CO2（密闭、常温、有一定压力）。b：加热（密闭、加热、低于临界值）。c：临界状态（密闭、达临界状态、相界消失）。d：减压（临界状态下排气）。e：干燥结束（常温、常压、排气结束、样品干燥）A：HCP-2型临界点干燥器结构图。B：样品室放大剖面图扫描电镜技术

TechniquesofScanningElectronMi