DB22T 3172.3-2020 流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测 第3部分：H3N8亚型马流感病毒 .docx
ICS11.220B41
DB22
吉林省地方标准DB22/T3172.3—2020
流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测第3部分：H3N8亚型马流感病毒
Real-timeRT-PCRdetectiononHAandNAgenesofinfluenzavirusPart3：H3N8subtypeequineinfluenzavirus
2020-10-14发布2020-10-30实施
吉林省市场监督管理厅发布
I
DB22/T3172.3—2020
前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。
DB22/T3172《流感病毒HA和NA基因检测荧光RT-PCR法》分为四个部分。——第1部分：H7N9亚型禽流感病毒；
——第2部分：H7N4亚型禽流感病毒；——第3部分：H3N8亚型马流感病毒；——第4部分：H7N7亚型马流感病毒。本部分为DB22/T3172的第3部分。
本部分由长春海关提出并归口。
本部分起草单位：长春海关技术中心。
本部分主要起草人：王伟利、王准、王玮琳、姚贵哲、刘金华、肖芳、李玥、马文晨、杨帆、蔡阳、马玲。
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DB22/T3172.3—2020
流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测第3部分：H3N8亚型马流感病毒
1范围
本标准规定了H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、试验条件、试剂与材料、仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理及试验报告。
本标准适用于H3N8亚型马流感病毒检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫
3缩略语
下列缩略语适用于本文件
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold）DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethypyrocarbonate）
HA：血凝素（Hemagglutinin）
NA：神经氨酸酶（Neuraminidase）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）
RT-PCR：反转录聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）Taq酶：Taq脱氧核糖核酸聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase）
4原理
根据H3N8亚型马流感病毒HA基因和NA基因序列设计特异引物和探针，探针结合部位在扩增片段内部。HA基因和NA基因探针分别在5’端标记FAM和CY3荧光素作为报告荧光基团，3’端分别标记MGB和BHQ1作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解，探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。
5试验条件
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DB22/T3172.3—2020
5.1生物安全措施
所有培养物和废弃物的处置应按照GB19489中的有关规定执行。5.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27401的规定。
6试剂与材料
6.1试剂
6.1.1阴性对照：可采用经灭活的不含马流感病毒的鸡胚尿囊液。
6.1.2阳性对照：非感染性体外转录RNA，-20℃保存备用。
6.1.32×RT-PCRBuffer。
6.1.4RTEnzymeMix。
6.1.5Taq酶。
6.1.6DEPC水：0.1%DEPC处理后的去离子水。
6.1.7引物与探针：见表1。
表1H3N8亚型马流感病毒HA基因和NA基因引物和探针
HA基因
引物F1
5’–TGGATTTCATTTGCCATATCAT–3’
引物R1
5’–GCAAATGTTGCATCTAATRTTG–3’