血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳01掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。03熟悉血清电泳在临床诊断的作用。02熟悉电泳的基本过程与定量方法。实验目的实验原理—PH＜PI时，蛋白质带正电荷，移向负极PH＝PI时，蛋白质不带电荷PH＞PI时，蛋白质带负电荷，移向正极迁移率：是指单位电场强度是离子运动的速度，也称电泳度。醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。将醋酸纤维素溶于丙酮等有机溶液中，可涂布形成均一细密的微孔薄膜，厚度约0.1~0.15mm。血清中各种蛋白质的等电点不同，在同一高于其等电点的PH值缓冲液中，他们都带负电荷，但电荷数量不同。同时，各种蛋白质的分子大小不一，所以在同一电场的电泳迁移率不同。在醋酸纤维素膜上可分为五条区带。电泳迁移率最大的是白蛋白，其后依次为α1、α2、β和γ球蛋白。染色后经透明处理可直接在光密度计上扫描定量。实验器材与试剂器材电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、滤纸、醋酸纤维素薄膜、点样器DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-3型电泳箱电极缓冲液：巴比妥缓冲液（PH8.5~8.7、I=0.06）:称取巴比妥2.21g、巴比妥钠12.36g于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷却至室温后，用蒸馏水补足至1L。01染色液：氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B0.1g，溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml、甘油0.5ml，使溶解，然后将磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，再以蒸馏水补足至100ml。01试剂：透明液：称取柠檬酸21g和N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解，并稀释至50ml。亦可选用十氢萘或液体石蜡透明 （注明各试剂的作用)02漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。01续：试剂准备：将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极室内，是正负极室的吖液面等高，电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。1浸膜：先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一直线（点样线），再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止（约10~20min）。当膜条无可见的白斑或点状的不透明区时，取出，将薄膜无光泽面向上，平放于干净滤纸，薄膜上再放一张干净滤纸轻轻吸去多余的缓冲液。2实验操作点样:用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上，用点样器或宽1.5cm的X光软片末端处蘸取少许样品，垂直轻印（迅速均匀）到薄膜点样线上，使血清完全渗透到薄膜内，形成一定宽度、粗徐均匀的直线。（注：点样量不宜过多！）这是关键步骤，印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。平衡：将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，点样端靠近负极，薄膜两端要紧贴纱布或滤纸，中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。电泳：将电泳槽正负极与电源正负极接好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm,如有10条宽2cm的膜条，其总宽度为20cm,应使用电流强度为20cm*0.5mA/cm=10mA。电压15V/cm。通电50分钟左右，使电泳区带展开3~3.5cm。关闭电源。染色：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色5~10min（以蛋白带染透为止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。漂洗液可回收。010302透明：吸取薄膜上的漂洗液（以防止透明液被稀释影响透明结果），将薄膜浸入透明液中2~3分钟（延长一些时间亦无碍）。取出，以滚动方式平贴于洁净无划痕的载玻片上（勿产生气泡）。将此玻璃片树立片刻，除去一定量透明液后，置已恒温90~100°C烘箱内烘烤10~15min，取出冷至室温。用此法透明的各蛋白质区带鲜明，薄膜平整，可供直接扫描和永久保存（若用十氢萘或液体石蜡透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，此法透明的薄膜不能久藏，且易发生皱折）。扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进行扫描分析。7.定量（光密度计扫描法）计算公式：各组分蛋白质%=Ax/At*100（Ax:各组分蛋白质的吸光度。At:各组分蛋白质吸光度的总合。）各组分蛋白质的绝对浓度（g/L）＝血清总蛋白（g/L）*各组分蛋白质的百分浓度（％）每次电泳时应交换电极可使两侧电泳槽内缓冲溶液的正负离子相互交换，使缓冲液的pH值维持在一定水平。每使用十次最好将缓冲液弃