出入境检验检疫实时荧光定量PCR检测鼠疫杆菌DNA操作规程.doc

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出入境检验检疫实时荧光定量PCR检测鼠疫杆菌（YP）DNA操作规程

1．适用标本

血清、内脏组织、土壤、蚤类等

2．仪器

ABI7500实时荧光PCR扩增仪

3．试剂

专业生物公司研发的鼠疫杆菌核酸扩增检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

4．标本DNA提取

用商业DNA提取试剂盒提取总DNA

5．PCR扩增

从试剂盒中取出YP-PCRMIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。用量：YP-PCRMIX24μL，Taq酶系2μL，模板DNA/阳性对照DNA/阴性对照DNA：4μL。

可计算好所需试剂用量进行预混匀，再向每反应管内加入26μL预混液，最后加入模板DNA。10000rpm瞬时离心30s。将各反应管放入ABI7500PCR仪反应槽内

PCR反应条件：预变性：93

PCR反应条件：预变性：93℃2min

93℃30s

40个循环

55℃45s

6．结果分析判定

Ct值小于37个循环的为阳性；Ct值在37—40个循环之间的为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在37—40个循环之间，判定为阳性，没有荧光值增长为阴性。

阴性质控品结果需全部为阴性；YP-阳性对照的Ct值均应小于30。两个条件应同时满足，否则此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

7．注意事项

使用前请仔细阅读试剂盒说明书，并严格按照说明书进行操作。

所有使用的离心管、Tip头应高压灭菌，而且必须不含DNase。

PCR操作应严格按照要求分区（试剂配置区、标本处理区、PCR扩增区、电泳区）防止实验室污染。

所有试剂及待检标本应看作是传染物质，并且按照《传染病防治法》规定操作。

试剂盒-20℃保存，有效期12个月，避免反复冻融。

相关记录

实时荧光PCR检测原始记录