植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的试验技术与方法一-遗传.PDF

遗传 HEREDITAS(Beijing)9(5):41-431982 礴 爪 ～ 勺 爪 木 爪 实 木 爪 爪 验 爪 植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的 爪 爪 木 爪 爪 技 爪 爪 爪 爪 爪 爪 术 木 爪 爪 一种简便有效方法 余 爪 与 爪 爪 木 爪 方 爪 爪 爪 许 耀 贾敬芬 郑国锡 梅 木 木 法 W 沙 宙 兰（州大学生物系） 一 由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 2．正常的向日葵愈伤组织。 感染引起的植物冠4瘤 (crowngall)细胞除 二（）试剂与设备 具激素自养性生长特性外，还具有一类特殊的 1．试剂 精氨酸，章鱼碱，胭脂碱，a-酮 基因产物，即冠瘦碱 (opines)。常见的冠瘦碱 戊二酸，丙酮酸钠，乙醇，乙酸，甲酸，菲酮， 主要有章鱼碱 (octopine）和胭脂碱 (nopaline) NaOH，甲基绿，MS培养基2，『成份。 等。催化章鱼碱合成的酶为章鱼碱合成酶(oct- 2．设备 电泳仪，平板电泳槽，离心机， opinesynthase)，或叫Lysopine脱氢酶 [D- 电吹风，微量进样器，紫外检测灯，Whatman （＋）一lysopinedehydrogenase，简称 LpDH]o 3或1号层析纸或新新3号滤纸。 催化胭脂碱合成的酶为胭脂碱合成酶(nopaline （三）操作程序 synthase)，或称胭脂碱脱氢酶 (nopalinedehyd- 1．预培养 将待测组织切成小块，转人 rogenase，简称 NpDH)。即在NADH存在条 含 1omm 精氨酸-I-5mMa-酮戊二酸 （用于胭 件下，LpDH催化丙酮酸与精氨酸的缩合反应， 脂碱型冠廖瘤组织中NpDH活性的检测）或 形成章鱼碱；NpDH催化。一酮戊二酸和精氨酸 lOmm精氨酸＋5mM丙酮酸钠 用（于章鱼碱型 的缩合反应，形成胭脂碱。 冠廖瘤组织中LpDH活性的检测）的MS培养 冠瘦碱的合成是由于根癌农杆菌 Ti质粒 基上。 在一般培养条件下保温培养24小时以 的T-DNA 转（移DNA）在植物细胞中发生了 上。 转移、整合与表达的结果。因此，植物细胞中冠 2．冠瘦碱的提取 取经预培养的待测组 瘤碱合成酶活性的存在常被用作T-DNA转化 织于小研淋中。加人等体积的80关乙醇。研 与否的一个主要证据。近年来，研究者们基本 磨后，将匀浆液转人具盖的离心管中。于室温 都采用 Otten等的方法a〔来检测植物细胞中冠 下浸提 1小时以上。离心后弃去沉淀。 瘦碱合成酶的活性。我们对此法进行了一些改 3．点样 用微量进样器取浸提的上清液 进，即在活体状态下来检测冠瘤碱合成酶活性 3微升左右在层析纸上点样。以胭脂碱、章鱼 的存在。现以向日葵冠瘦瘤组织及其正常愈伤 碱或胭脂碱＋章鱼碱＋精氨酸 （各0.1毫克／毫 组织为例作一介绍。 升）为标准样品。 4．纸电泳 电泳液为乙酸 ：甲酸 ：水二 材 料 与 方 法 12:15:63。以0.5外甲基绿乙醇溶液为电泳指 一（）材料 1．根癌农杆菌章鱼碱型菌株 B6S3和胭脂 XuYaoetal.:ASimpleandEfficientMethod for theDete