_氨基酸分析报告.ppt
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3.4.4 侧链R基参加的反应 其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。 Pauly(波利 )反应,可用于检测酪氨酸。 半胱氨酸侧链上的巯基(--SH),反应性能很高,在微碱性pH下,--SH基发生解离形成硫醇阴离子(--CH2—S-)。并可进一步与烷化剂反应生成稳定的烷基衍生物: 氨基酸完全质子化时,可以看成是多元酸。 侧链不解离的中性氨基酸可看作二元酸,例如甘氨酸。 - + H + H + H + H + + - 阳离子(A+) 兼性离子(A0) 阴离子(A-) Ka1 = [A0] [H+] [A+] 第一步解离 Ka1代表?-碳上-COOH的解离常数 甘氨酸的解离: - + H + H + H + H + + - H H H A+ A0 + H+ Ka1 Ka2 = [A-] [H+] [A0] 第二步解离 Ka2代表?-碳上-NH3+的解离常数 A0 A- + H+ Ka2 氨基酸的解离常数可用测定滴定曲线的实验方法求得,以甘氨酸为例,滴定可从甘氨酸盐酸盐、等电甘氨酸或甘氨酸钠溶液开始。 甘氨酸盐酸盐 等电甘氨酸 甘氨酸钠 当0.1mol甘氨酸溶于水时,溶液的PH值约为6.0,如果用标准的氢氧化钠进行滴定,以加入的氢氧化钠对PH作图,则得滴定曲线B段,在PH9.60处有一拐点,这一拐点就代表甘氨酸的兼性离子有一半变成阴离子。从甘氨酸的解离公式(2)可知,当兼性离子有一半变成阴离子,即[GLY±]=[GLY-]时,则K2=[H+],两边各取负对数得PK2=PH,这就是曲线B段拐点处的PH9.60。 K2= [Gly- ] [H+] [Gly±] 利用Handerson-Hasselalch公式,可算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例: [质子受体] pH = pKa + log ----------------- [质子供体] 谷氨酸和赖氨酸的滴定曲线 20种基本氨基酸,除组氨酸外,在生理pH(7左右)下都没有明显的缓冲作用,因为其pKa都不在pH7附近。 组氨酸咪唑基的pKa值为6.0,在pH7附近,有明显的缓冲作用。 不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在: 正离子 两性离子 负离子 等电点(isoelectric point):氨基酸所带静电荷为“零”时,溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(isoelectric point),以pI表示。 3、氨基酸的等电点 实验证明在等电点时,氨基酸主要以两性离子形式存在,但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式,还有极少量的中性分子。 当溶液的pH=pI时,氨基酸主要以两性离子形式存在。 pHpI时,氨基酸主要以正离子形式存在。 pHpI时,氨基酸主要以负离子形式存在。 等电点的计算 氨基酸的等电点可由其分子上解离基团的解离常数(pK)来计算。 pI=(pK1+pK2)/2 氨基酸的等电点PI值相当于该氨基酸的两性离子状态两侧的pK值的一半。 等电点的计算 K1= [Gly±] [H+] [Gly+] K2= [Gly- ] [H+] [Gly±] pI时, [Gly+ ] = [Gly- ] [Gly±] [H+] K1 = [Gly±] K2 [H+] [H+]2=K1K2 pH=(pK1+pK2)/2 pI=(pK1+pK2)/2 pI =(2.34+9.60)/2=5.97 Gly 中性氨基酸的等电点都在PH值6.0左右 对于R基无解离基团的氨基酸:中性氨基酸(以Gly为例) 酸性氨基酸,以Asp为例: 对于R基有解离基团的氨基酸:pI等于等电形式两侧的pK值之和的一半,以等电形式为中心,另一个pK值为第二级解离,可以忽略不计。 Asp,Glu,Tyr和Cys的pI等于两个小的pK值之和的一半: pI=(pK1+pKR)/2 酸性氨基酸的等电点值较小 R 3 R 碱性氨基酸,以Lys为例: Lys,Arg和His的pI等于两个大的pK值之和的一半: pI=(pK2+pKR)/2 碱性氨基酸(二氨基一羧基)的等电点值较大 R R A pK1 pK2 pI pI pK3 pK3 pK2 pK1 加入的OH-mL数 加入的OH-mL数 pH pH 一氨基二羧基AA的等电点计算: pI= 2 pK′1+pK′2 二氨基一羧基AA的等电点计算: pI= 2 pK′2+pK′3 谷氨酸(A)和赖氨酸(B)滴定曲线和等电点计算 中性氨基酸:pK1,为α—羧基的解离常数,
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