青稞中β-1，3-葡聚糖酶分离纯化及性质分析.pdf

青稞中B一1,3一葡聚糖酶分离纯化及性质研究 生物化学及分子生物学专业 研究生丁平 指导老师杜林方 8·1，3一葡聚糖酶【E．C．3．2．1．39]存在于大多数高等植物中，并由一个小基因家 族编码，在植物不同的生理活动中起着重要的作用。如细胞分裂、小孢子发生、 B 花粉的形成、受精作用和胚的发生，并参与了植物对损伤，低温、臭氧和uv 等做出的生理反应，而且是植物种子发芽和防御反应中的关键物质。青稞是我 国青海、西藏特有的高原作物，研究发现青稞种子中含有较高的B．1，3．葡聚糖 酶，但是未有从青稞中提纯0-1，3-葡聚糖酶的文献报道。本文运用硫酸铵沉淀、 稞发芽种子的胚中提纯得到一种B．1，3-葡聚糖酶，分析了此酶的等电点、最佳 反应温度和最佳反应pH，运用非变性凝胶电泳胶板直接活性染色方法对酶进行 了快速鉴定，测定了近紫外和远紫外圆二色光谱，并计算出酶二级结构和三级 结构，并结合酶活测定和内源荧光光谱分析，考察了金属离子对酶的影响，并 对酶热稳定性和荧光发射光谱变化进行研究。 结果表明：采用上述方法，可以从38克发芽青稞种子胚中 提纯得到0．98 毫克的B．1，3．葡聚糖酶，此酶可以特异水解海带多糖。在非变性PAGE银染时 只出现一条带。活性染色也在同一位置出现了唯一条亮红色的活性带。 SDS．PAGE表明纯化酶的分子量为31kDa，属于单亚基酶。聚焦电泳分析等电 点口I值为8．1，为碱性酶蛋白。此酶的最适反应温度和反应pH分别为35C和 5．0。根据CD谱计算酶的二级结构，表明其含有14．8％q．螺旋，22．93％B．折叠 和62．2％无规则卷曲。外加金属离子对酶有激活作用，且与金属离子的种类、价 态和浓度相关，其中二价离子的作用大于一价离子，特别是低浓度ca2+或Ba2+ 可以显著提高酶活。蛋白内源荧光光谱分析也表明，Na+对酶的荧光发射峰的影 响较小；而加入Mg”，cE+或Ba2+后荧光强度下降及发射峰红移，且以Ca2+和 Ba2+影响最大。这可能是金属离子与蛋白质的侧链基团作用，而使酶分子中的 Trp和=yr残基的微环境发生了改交。热稳定性实验结果表明，此13-1，3一葡聚糖 酶对热敏感，随温度升高，酶活力下降；内源荧光分析也显示荧光强度增加、 最大发射峰蓝移。此酶可能属于热敏感蛋白，与其二级结构中无规则卷曲较多， 而a．螺旋和B．折叠较少有关。 关键词： 青稞、13．1，3．葡聚糖酶、活性染色、圆二色光谱、荧光光谱、金属离 子 Purificationand Characterizationof from fl-1，3-glucanases highland barley Specialty：BiochemistryMolecular Biology Graduatestudent Tutor DingPing Du Linfang in asmall 13-1，3-glucanase[E．C．3．2．1．39]ispresent manyhighplants，encoded by rolesindiverse and genefamily．Itplaysimportant