苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因vmpg7和-中国农业科学.pdf

中国农业科学 2016,49(8):1489-1498 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.08.006 苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7 和 Vmpg8的功能 许春景，吴玉星，戴青青，李正鹏，高小宁，黄丽丽 （西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali ）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase， PG)基因 Vmpg7 和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致 病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响，明确 Vmpg7 和 Vmpg8 在病菌致病过程中的生物学功能，为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过 qRT-PCR 检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后 PG 家族内其他 PG 基因的表达量；利用 double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除，经4对引物PCR检测及 Southern blot 验证获得基因单敲除和双敲除突变体，并利用gap-repair技术对基因进行回复；利用PDA培养基 常规培养法观察突变体营养生长状况；通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影 响；通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性；利用Czapek培养基培养法分析突变体 对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明，Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73 和8.19倍。 通过基因敲除技术，分别获得 3 个 Vmpg7 基因单敲除突变体、1 个 Vmpg8 基因单敲除突变体和 3 个 Vmpg7/Vmpg8 基因双敲除突变体，并获得了 Vmpg7 和 Vmpg8 单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到 PDA 培养基上，菌落 形态和生长速率均没有发生变化；接种到苹果叶片和枝条上，Vmpg7 单敲除突变体及 Vmpg7/Vmpg8 双敲除突变体 在叶片和枝条上的致病力显著降低，而 Vmpg8 单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低；进一步对果胶酶活性及 对果胶的利用分析，发现 Vmpg8 单敲除突变体及 Vmpg7/Vmpg8 双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低，且所有 突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外，基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率 均回复到野生型菌株 03-8 水平。重要的是，Vmpg7/Vmpg8 双敲除后影响了 PG 家族中其他 PG 基因的表达水平，3 个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用，通过调 节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。 关键词：苹果树腐烂病菌；多聚半乳糖醛酸酶；果胶酶；基因敲除；致病力 Function of Polygalacturonase Genes Vmpg7 and Vmpg8 of Valsa mali XU Chun-jing, WU Yu-xing, DAI Qing-qing, LI Zheng-peng, GAO Xiao-ning, HUANG Li-li (College of Plant Protection, Northwest AF University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi) Abstract: 【Objective 】Transcriptom