禽流感疫胶体金快速检测技术研究.pptx
禽流感免疫胶体金快速检测技术研究
研究的背景和意义
●AI爆发时来势凶猛，新型毒株的出现和致病力的增强等特点始终威胁着畜牧业和人类健康，对禽流感进行实时监测已成为畜禽疾病检测的重要内容。禽流感的检测方法虽然已有较多报道，但多数方法需要特殊的仪器设备，且在灵敏性、特异性等方面存在不同差异，多数方法只能在实验室中完成。因此急需建立一种适合基层使用的禽流感快速检测方法。
●免疫胶体金层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来的一种快速免疫学检测技术。近几年该技术已经引起兽医界的重视，猪瘟免疫抗体、口蹄疫抗体、猪伪狂犬病抗体快速检测及鸡传染性法氏囊快速诊断等均有用相关免疫胶体金层析测试条进行快速检测的试验。
●禽流感免疫胶体金测试条可在十几分钟内实现对禽流感的快速检测，该测试条在国外已有生产，我国还未见有相关研究的报道。本试验将免疫胶体金诊断技术用于AIV的检测，该方法的确立将为实现临床快速、准确诊断禽流感提供有效检测方法。
研究内容
1.通过对抗AIVMcAb、羊抗AIV多克隆抗体的制备，获得高效价的单抗和多抗。
2.制备性能稳定、免疫学活性好的金标AIVMcAb,并将其将其固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将抗AIV多克隆抗体结合于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体，制备AIV免疫胶体金层析测试条，初步建立AIV免疫胶体金层析法。通过与双抗体夹心ELISA比较、对AIV免疫胶体金层析法作出评定。
胶体金
颗粒的
制备
确定最适标
记量、标记
条件
制备金
标抗体
结合垫上喷
涂金标抗体
免疫胶体金测试条
的组装
建立禽流感夹心ELISA诊断方法
比较
建立AIV免疫胶体层析法
BALB/c鼠
采小鼠脾脏
集小鼠血清
细胞融合，筛
选、制备、鉴
定、提纯单克
隆抗体
间接
ELISA法
制备羊抗
AIV多克
隆抗体
对AIV免疫胶体金层析法作出评定
NC膜上喷涂各种抗体
技术路线
禽流感抗原免疫动物
处理结合垫及样品垫
购进羊
抗鼠IgG
羊
试验一抗AIVMcAb的研制
●AIV抗原的纯化及鉴定
●BALB/c小鼠的免疫
●阳性McAb筛选方法的建立
●细胞融合及培养
●McAb的大量制备及生物学特性鉴定：
McAb的Ig亚型鉴定，McAb特异性鉴定试
验，McAb的提纯及效价测定
标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶SephadexG-
200柱层析，分次收集并测定各管蛋白含量，经
过0.01mol/LPBS(pH为7.4)洗脱，所得的洗脱峰如图。
AIV的分离纯化
系列1
0D280值
——
AIV胶体金试纸条鉴定结果
待检样→——阴性对照
收集61—78号管内样品，用国外标准禽流感胶体金试纸条初步鉴定结果如图。
123
1,泳道为提纯提纯前AIV抗原；2泳道为提纯后AIV抗原；
3泳道为蛋白质Marker
AIV10%SDS—PAGE鉴定结果
Ab
Ag(μg/ml)
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
空白
十一
十一
十一
十一
十一
40
1.850.084
1.680.073
1.490.069
1.31.078
1.140.068
0.0570.058
20
1.790.079
1.610.072
1.430.068
1.280.079
1.110.072
0.0590.062
10
1.670.071
1.580.067
1.340.069
1.150.082
1.040.074
0.0610.066
5
1.450.064
1.260.074
1.130.070
0.970.076
0.860.087
0.0610.058
2.5
1.140.072
1.03.0.072
0.820.074
0.690.075
0.540.071
0.0580.063
1.25
0.980.076
0.730.079
0.510.071
0.340.069
0.210.089
0.0640.063
0.75
0.710.073
0.520.070
0.380.075
0.210.071
0.106
0.069
0.0620.061
0.35
0.570.084
0.390.081
0.230.079
0.190.075
0.080.089
0.0610.057
间接ELISA抗原与抗体的工作浓度的确定
抗原工作浓度为10μg/ml,一抗的工作浓度为1:8000
融合前后细胞形态观查
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