盐析法免疫球蛋白的纯化实验报告.docx

盐析法免疫球蛋白的纯化实验报告 　　血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告　　一、实验目的　　掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。　　二、实验原理　　1.血浆IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。　　2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。　　3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。即称为该蛋白质盐析的饱和度。　　4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：　　在蛋白质要求达到50%以下时采用：　　V＝V0*/　　V0－－蛋白质溶液的原始体积　　C1－－所要达到硫酸铵饱和度　　C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度　　三、试剂与仪器　　饱和硫酸铵溶液，/l,的磷酸盐缓冲溶液，/L,的磷酸盐缓冲溶液　　四、实验步骤　　1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和/l,的磷酸盐缓冲溶液，混合。向其中加入饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%，加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀　　2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。　　3.将所有的沉淀再溶于/l,的磷酸盐缓冲溶液后。滴加饱和硫酸铵溶液　　，使其饱和度达到35%，加完后，4度放置20min，以3000r/min离心15min，上清液弃去，即制得粗制的IgG沉淀。　　4.将上沉淀溶解于/L,的磷酸盐缓冲溶液中。摇匀，然后配制成10mg/ml的IgG溶液1ml。　　5.将配制好的gG溶液滴加到凝胶中进行电泳。　　五、实验结果　　所得gG沉淀为　　凝胶电泳分成5个区带。　　标准的电泳分离是形成10个区带，由于IgG蛋白质在一系列的操作过程后，硫键会断裂，形成两个大亚基各两个小亚基，由于大亚基分子量较大，在电泳过程中所受阻力也就大，相　　蛋白纯化硫酸铵沉淀盐析　　还能想起那些在荧屏中曾经震撼过我们，具有超能力的英雄么？　　蜘蛛侠，敏捷，灵活迅速飞流直下，忽闪直冲高楼；　　绿巨人浩克，力量，速度，耐力，在我们的想象力中膨胀；　　还有，我们随身携带星形盾牌，品格高尚的美国队长……幻想里中的人物形象存在我们的记忆力，然而生物背景出身的我们，总归要锻炼出属于自己的实验技能，即便是相同的实验步骤，每个人做出来的结果也不尽相同，差别在哪？反复练习，用心总结出属于自己的心得，转化为自己的实验“超能力”吧。本文总结了蛋白纯化硫酸铵沉淀详细的实验原理、步骤，供大家参考。　　-------锻炼属于我们自己的实验“超能力”之一　　这次，我们所要分享的便是一种很常见，但是也很重要的蛋白质纯化方法：硫酸铵沉淀蛋白法，一起走进实验室吧。　　硫酸铵沉淀法是粗分离蛋白时常用的纯化和浓缩蛋白的技术。蛋白质的溶解度和盐浓度密切相关，在低浓度的条件下，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度增加；但在高浓度的盐溶液里，盐离子竞争性的结合蛋白表面的水分子，破坏蛋　　白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白质在疏水作用下聚集形成沉淀。每种蛋白质的溶解度不同，因此可以用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵的溶解度大，解离形成大量的NH4+、SO42-离子，会结合大量的水分子，使蛋白质的溶解度下降，另外，其温度系数小，不易使蛋白质变性，因此，蛋白质粗分离时硫酸铵沉淀法是很重要的一种技术，后续可采用层析技术进一步纯化蛋白，效率更高。硫酸铵沉淀法是常用的分离免疫球蛋白的方法。　　各种不同蛋白质盐析需要不同浓度的硫酸铵溶液。在(来自:写论文网:盐析法免疫球蛋白的纯化实验报告)实验中建议配置不同梯度浓度的硫酸铵溶液来确定蛋白质沉淀所需的最佳浓度。　　参照如下表格配置不同浓