细胞实验操作基本流程.docx

细胞实验操作基本流程 （基于明确的细胞试验计划） 1. 实验物品准备 1.1 实验耗材准备 书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。 操作准备：物品清洗、干燥、打包灭菌、合理放置。 1.2 实验试剂准备 书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。 操作准备：选择合适的物品存放地点；使用前集中放置；需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好；需要无菌配制的试剂在无菌操作要求下配制。 2. 实验预约 2.1 操作预约：401室在预约本上登记；分析测试中心向屈老师交申请单后在预约本上登记。 2.2 细胞冻存复苏预约：每周定时开放液氮罐，由负责同学在群里通知。 2.3 细胞检测预约：填写申请单，向主管老师申请。 3. 细胞房环境检查 3.1 清洁消毒：操作前后有无清洁台面、地面，并行紫外线杀菌10-15分钟。 3.2 仪器设备：运行是否正常，有无灯光闪烁报警或标志警示，有无异常状况。 3.3 台面：是否洁净无污垢，有无多余物品放置，必要物品是否放置齐备。 4. 清洁准备 4.1 洗手：肥皂洗——5‰新洁尔灭泡手10秒——70%酒精喷手 4.2台面物品放置：正中：酒精灯；左侧：吸管及其他耗材盒子；右侧：试管架、大镊子、酒精棉球瓶、打火机、移液器；左上方：试剂瓶；右上方：废液缸 5. 实验操作 5.1 基本操作：换液、传代、冻存、接板、复苏、细胞计数、细胞观察 5.2 垃圾处理：培养基、缓冲液等使用过的无害废液用废液缸装；固体垃圾丢入垃圾筐中 6. 实验善后 6.1 可回收实验耗材处理：吸管、试管、离心管等可反复使用的耗材按标准流程清洗。 6.2 不可回收实验废物处理 6.2.1 酸碱类废液分类倒入废液瓶存放，由学院通知处理 6.2.2 无害废液弃入水槽，大量流水冲洗 6.2.3 固体垃圾放入垃圾袋，丢入垃圾桶 6.3 种子细胞处理：实验过程中需要保种或实验完成后仍有未用完的种子细胞，按标准流程进行细胞冻存，以待后续使用。 6.4 实验试剂处理：未用完的试剂重新放回合适的存放地点；如试剂污染或变质，按实验废物处理。 6.5 报备：耗材、试剂如需补充，需要向老师申请批准购买；仪器设备如有损坏，需要告知负责同学或老师进行维修。 7. 清洁值周和安全检查 7.1 清洁值周：轮流进行，以导师分组，每日例行清洁和周二、周五大扫除，需要按要求进行清洁并在值周表上登记及拍照。 7.2 安全检查：清洁值周的同时需要每天巡视细胞房、准备间内的电器设备，有情况需要及时上报。 注意事项： 1、试验计划三原则：要做什么、为什么这么做、准备怎么做 2、实验操作三原则：多看、多问、多想 3、突发事件处理：及时向负责同学、老师汇报情况 细胞操作相关仪器设备使用 恒温干燥箱使用注意事项 注意事项 (一)干燥箱恒温干燥时恒温室下方的散热板上，不能放置物品，以免烤坏物品或引起燃烧。 (二)放入箱内的物品不应过多、过挤。 (三)严禁把易燃、易爆、易挥发的物品放入箱内，以免发生事故。 (四)如果发现干燥箱箱门下方红灯报警必须尽快切断电源。 (五)放置物品干燥时间不超过24小时。 二氧化碳培养箱使用 箱门应轻开轻闭，避免粗暴开关。取出细胞时应避免箱门长时间敞开，以免培养箱内环境不稳定，孵箱中的水盆应定期（每2周左右）更换无菌双蒸水，并擦洗水盆，紫外照射30分钟。 二氧化碳气瓶更换 先关闭总阀和分压阀，更换后先开总阀，再慢慢调整分压阀，指针总阀在5分钟左右，分压阀指针在0.15左右。 超净台使用 使用超净台工作15分钟前开紫外灯进行照射灭菌，在进入操作之前应关掉紫外灯，10分钟左右后进入。超净台上力求简洁，以利于保持无菌状态，每一步操作均应用酒精擦拭，不宜对着超净台说话。 倒置相差显微镜使用 分为3点： 相差装置的调换与安装。卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可以吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 调焦。打开光源，旋转激光器装盘将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进进光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。 合铀调整。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻