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核酸探针技术及应用

基因检测技术发展,使对一些疾病诊疗达成了特异性强、敏感性高及简便快速目。多年来多种血清学方法发展很快,但血清学方法关键是测抗体,是间接证据伴随分子生物学发展,应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术,该技术是现在基因检测最常见方法,现在已成为诊疗多种感染性疾病,恶性肿瘤,遗传病,检测抗生紊耐药性,法医学判定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面一个关键手段。本文关键介绍了核酸探针技术原理,核酸分子杂交方法及核酸探针应用等方面。

一、核酸探针技术原理

DNA或RNA片段能识别特定序列基因DNA片段,能与互补核苷酸序列特异结合,这种用同位素非同位素标识单链DNA片段即为核酸探针。

核酸探针技术是将双链DNA经加热或硷处理,使硷基对间氢链被破坏而变性,解开成两条互补单链。它们在一定温度和中性盐溶液条件下,又可按A—T,G—C碱基配对标准重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)条件下才能实现。正是因为双链DNA这种可解离与重组合性质,才可用一条已知单链DNA,用放射性同位素或其她方法标识后制备成核酸探针,与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上变性单链DNA进行杂交,(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基,称为靶)再用放射自显影或其她显色技术检测,以确定有没有与探针DNA(或RNA)同源或部分同源DNA(或RNA)存在。因为探针只与靶病原体DNA或RNA杂交,而不与标本中存在其她DNA或RNA杂交。

二、核酸探针技术基础方法

被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成份或直接提取DNA,用多种方法处理DNA使其变性,把DNA双螺旋两条链分开,单链DNA结合于固态基质上,(如滤膜)使其固定。再加上已制备好探针进行杂交,探针便可找出已固定DNA中互补序列,与之配对结合,然后洗掉未结合部分,因为探针已将放射性同位素掺入,再用x射线敏感胶片自显影,见黑色影印者即为阳性。探针亦可用3H标识,最终用液闪计数器计致。还可用生物素,抗生物素等标识,最终用酶标法显色,均能得到满意效果。

1核酸探针制备

核酸探针可分为DNA探针、CDNA探针、RNA探针和寡糖核苷酸探针,因其种类不一样制备方法也不一样。

1．1DNA探针

DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针制备最简单,只要将染色体DNA分离纯化,然后进行标识即可。基因片段探针则需要将染色体DNA用限制性内切酶酶解,得到很多片段,然后与质粒重组,转化大肠杆菌(E·coli),筛选含特异目基因片段克隆株进行扩增,再提取基因片段作探针。

1．2CDNA探针

经过提取纯度较高对应mRNA或正链RNA病毒RNA,反转录成CDNA作为探针。也能够深入克隆在大肠杆菌中进行无性繁殖,再从重组质粒中提取CDNA作探针。

1．3RNA探针

有些双链RNA病毒基因组在标识后,可直接用作探针。另一个是从CDNA衍生而来RNA探针,可由很强RNA聚合酶转录而得。其优点为CDNA探针所不及,因为RNA—RNA复合物比DNA—RNA复合物稳定,所以其灵敏度可提升10倍以上。

1．4寡核苷酸探针

用DNA合成仪能够合成50个核苷酸以内任意序列寡核苷酸片段,以此作为核苷酸探针,也可将它克隆到M13系统中使之释放含探针序列单链DNA,使探针制备和标识简化。

2核酸探针标识

核酸探针过去采取放射性同位素进行标识,常见标识物有α32PdNTP,35SdNTP等。同位素选择是依检测类型而定,制就DNA探针先经加热变性成单链后再与固定于硝酸纤维素膜上待测DNA杂交,如为同源则与之结合,经放射自显髟后,膜上出现黑色区。放射性同位素标识优点是敏感度高,对被检样品处理要求不高,假阳性率小,且32P替换磷原予不改变碱基空间结构,所以不影响杂交反应动力学曲线。其缺点是半衰期短,费用昂贵,同时需防护设备,另外放射自显影时问较长。所以多年来发展了非放射性标识,用于标识非放射性物质有金属(如汞),半抗原(如地高辛),生物素。和酶等,应用较多是生物素。非放射性标识特点是保留时问长,检测时使用方便,其最大缺点是灵敏度通常比放射性同位素低,但最近报道用化学发光物吖啶酯直接标识DNA探针,用化学发光仪检测杂交体,其灵敏度超出放射性同位素标识探针。能够予料化学发光物标识技术和均相杂交技术相结合可能是未来核酸探针分析技术发展方向。

在这里介绍一个非放射性标识“生物素核酸探针”,其基础原理为:生物素(Biotin)是一个B族维生素,能与抗生素蛋白——亲和素(Avi