结核菌素皮肤试验γ干扰素释放试验两步法的操作技术规范.docx

结核菌素皮肤试验γ干扰素释放试验两步法的操作技术规范

结核菌素皮肤试验γ-干扰素释放试验两步法操作技术规范

试验前准备

1.人员要求

参与试验的工作人员应经过专业培训，熟悉结核菌素皮肤试验（TST）和γ-干扰素释放试验（IGRA）的原理、操作方法、结果判读及相关注意事项。具备严格执行无菌操作的技能，能够准确采集样本、处理试验试剂并正确进行各项操作。

2.材料准备

-结核菌素（PPD）：选择符合国家标准的结核菌素，确保其效价和质量稳定。安瓿瓶应无破损、无泄漏，在有效期内使用。

-IGRA试剂盒：选用经过国家药品监督管理部门批准的合格产品，其组成成分应包括采血试管、抗凝剂、抗原试剂、对照试剂、细胞培养液、酶联免疫吸附测定（ELISA）相关试剂等。试剂盒应按照说明书的要求进行储存和运输，避免因储存条件不当影响试剂的活性和稳定性。

-其他耗材：无菌注射器（1ml）、采血针、酒精棉球、无菌棉球、胶带、记号笔、实验室离心机、恒温培养箱、酶标仪等。所有耗材均应符合相关质量标准，确保无菌、无热原。

3.环境要求

试验应在清洁、安静、光线充足的实验室环境中进行。室内温度应保持在20-25℃，相对湿度在40%-60%。操作台面应清洁、平整，并定期进行消毒处理，以防止交叉污染。

结核菌素皮肤试验（TST）操作步骤

1.皮肤消毒

用酒精棉球消毒受试者前臂掌侧中下1/3处皮肤，消毒范围直径约5cm。消毒后等待酒精完全挥发，避免酒精刺激皮肤影响试验结果。

2.结核菌素注射

用1ml无菌注射器抽取适量结核菌素（PPD），排尽空气。将针头斜面向上，与皮肤呈5°-10°角刺入皮内，缓慢注入0.1ml结核菌素。注射后应使局部形成一个直径约6-10mm的皮丘，如皮丘未形成或形成过小，应重新注射。

3.标记与记录

用记号笔在注射部位周围做好标记，标明注射时间和部位。同时，详细记录受试者的基本信息、注射剂量、注射时间、注射部位等相关信息。

4.结果观察

在注射后48-72小时观察结果。测量硬结直径，用游标卡尺或直尺测量硬结的横径和纵径，以两者的平均值作为硬结大小。判定标准如下：

-阴性：硬结平均直径5mm。

-阳性：硬结平均直径5-9mm为一般阳性；10-19mm为中度阳性；≥20mm或虽20mm但局部出现水疱、坏死、淋巴管炎等为强阳性。

γ-干扰素释放试验（IGRA）操作步骤

1.采血

如果TST结果为阳性或需要进一步明确诊断，在TST注射后7天左右进行采血。采集受试者静脉血，一般用无菌采血针采集2-5ml，将血液注入含抗凝剂的采血试管中，轻轻颠倒混匀，避免血液凝固。

2.样本处理

将采集好的血液样本在2-8℃条件下保存，应在采血后6-8小时内进行处理。如果不能及时处理，可将样本在-20℃或-70℃条件下冷冻保存，但会影响检测结果的准确性。

-取适量血液样本加入到IGRA试剂盒中的细胞培养液中，按照试剂盒说明书的要求进行操作，一般需要将样本分为不同的实验组和对照组。

-实验组分别加入结核特异性抗原试剂（如ESAT-6、CFP-10等），对照组加入对照试剂（如培养液或阴性对照抗原）。

3.培养

将处理好的样本放入恒温培养箱中，在37℃、5%CO?条件下培养16-24小时。培养过程中应保持培养箱内温度和气体浓度的稳定，避免振荡培养箱，以免影响细胞的生长和干扰素的释放。

4.检测

培养结束后，取出样本，按照酶联免疫吸附测定（ELISA）的操作方法进行检测。具体步骤如下：

-洗涤：用洗涤液洗涤微孔板，去除未结合的物质。一般洗涤3-5次，每次洗涤后应将微孔板内的液体甩干。

-加酶标抗体：向每个微孔中加入适量的酶标抗体，轻轻振荡混匀，在室温下孵育一定时间，使酶标抗体与结合在微孔板上的γ-干扰素结合。

-再次洗涤：重复洗涤步骤3-5次。

-加底物显色：加入底物溶液，在室温下避光反应15-30分钟，使酶催化底物显色。

-终止反应：加入终止液，终止酶催化反应。

-读数：用酶标仪在特定波长下（一般为450nm）读取各微孔的吸光度值（OD值）。

5.结果判读

根据试剂盒说明书提供的判读标准，结合检测孔和对照孔的OD值来判断结果。一般来说：

-阳性：检测孔的OD值减去对照孔的OD值大于或等于试剂盒规定的临界值。

-阴性：检测孔的OD值减去对照孔的OD值小于试剂盒规定的临界值。

-不确定：检测结果不符合阳性或阴性标准，可能由于样本质量、操作误差或受试者自身免疫状态等原因导致。这种情况下，