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羊李斯特菌病诊断技术

羊李斯特菌病是由产单核细胞增多性李斯特菌引起的一种散发性人畜共患病，主要表现为脑膜炎、败血症和妊娠母羊流产等症状。其诊断技术对于有效防控该病至关重要，以下是详细的诊断技术介绍。

临床诊断

羊感染李斯特菌后的临床症状会因感染阶段和羊的年龄等因素有所不同。

-羔羊：多呈败血症症状。发病急，体温升高达40℃-41℃，精神沉郁，不食，呼吸困难，心率加快。可视黏膜发绀，有时见鼻孔流出浆液性或脓性分泌物。部分羔羊表现出神经症状，如运动失调、转圈、倒地抽搐等。病程短，常于1-3天内死亡。

-成年羊：以脑膜炎症状较为常见。病羊初期兴奋不安，共济失调，不断咩叫，行走时步态不稳，容易摔倒。有的病羊会出现头偏向一侧，沿一个方向做转圈运动，遇到障碍物则头顶不动。随着病情发展，病羊视力减退，反应迟钝，最终卧地不起，呈昏迷状态，一般在发病后3-7天死亡。妊娠母羊感染后常发生流产，多在怀孕后期，流产前一般无明显的先兆症状，突然发生流产。

虽然临床症状为诊断提供了初步线索，但很多其他疾病也可能有类似表现，因此仅依靠临床诊断无法确诊，还需要结合实验室诊断等方法。

病理诊断

-剖检病变

-败血症病变：在呈现败血症症状死亡的羊只中，可见到肝脏、脾脏肿大，表面有灰白色或黄白色的坏死灶，大小不一，有的如针尖大小，有的直径可达数毫米。淋巴结肿大、充血，特别是肠系膜淋巴结和肝门淋巴结。心外膜和心内膜有出血点，胃肠黏膜有不同程度的充血和出血。肺脏淤血、水肿，有时可见到肺炎病灶。

-脑膜炎病变：脑膜充血、水肿，脑脊液增多、变混浊。脑组织有炎症变化，严重时可见到软化灶。切开大脑半球，可见脑实质有点状出血。病理组织学检查可见脑膜和脑组织中有大量的炎性细胞浸润，主要是单核细胞和中性粒细胞。血管周围有淋巴细胞和单核细胞形成的袖套状浸润。在肝脏、脾脏、淋巴结等组织中可见到局灶性坏死和炎性细胞浸润，在坏死灶周围可发现革兰氏阳性、呈V字形排列的李斯特菌。

病理诊断能辅助临床诊断，但同样不能作为确诊依据，因为部分病变可能与其他疾病相似，最终确诊还需依靠实验室检测。

实验室诊断

细菌的分离培养

-病料采集：根据病羊的临床症状和病变部位，采集合适的病料。对于疑似败血症的病羊，可采集血液、肝脏、脾脏等组织；对于有神经症状的病羊，采集脑脊髓液、脑组织；对于流产母羊，采集流产胎儿的肝脏、脾脏、胎盘等组织。采集病料时要严格遵守无菌操作原则，避免污染。

-增菌培养：将采集的病料接种于增菌培养基中，如胰酪大豆胨液体培养基，置于37℃培养24-48小时。增菌培养的目的是增加细菌的数量，便于后续的分离培养。

-分离培养：将增菌后的培养物划线接种于选择性培养基上，如含抗生素的血琼脂培养基。李斯特菌在血琼脂培养基上可形成圆形、光滑、湿润、边缘整齐的小菌落，周围有狭窄的溶血环。挑取可疑菌落进行纯培养和进一步的鉴定。

生化鉴定

-触酶试验：将纯培养的菌落接种于含3%过氧化氢的载玻片上，若产生气泡，则为触酶阳性，李斯特菌触酶试验呈阳性。

-糖类发酵试验：李斯特菌能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖等产酸不产气，但不发酵乳糖、蔗糖等。常用的糖类发酵培养基有葡萄糖发酵管、果糖发酵管等，按照操作规程进行接种和培养，观察培养基颜色的变化来判断细菌对糖类的发酵情况。

-MR-VP试验：MR试验（甲基红试验）和VP试验（Voges-Proskauer试验）是鉴别细菌代谢产物的重要试验。李斯特菌MR试验阴性，VP试验阳性。

血清学诊断

-凝集试验：包括平板凝集试验和试管凝集试验。以已知的李斯特菌抗原检测病羊血清中的抗体。将病羊血清与抗原在载玻片或试管中混合，若出现凝集现象，则为阳性反应。该方法操作简单、快速，但特异性和敏感性相对较低，可用于初步筛查。

-酶联免疫吸附试验（ELISA）：具有敏感性高、特异性强、可同时检测大量样本等优点。其原理是将李斯特菌抗原包被于微孔板上，加入病羊血清，若血清中存在特异性抗体，则会与抗原结合，再加入酶标二抗和底物，通过检测吸光度值来判断结果。

分子生物学诊断

-聚合酶链式反应（PCR）：是一种快速、准确的检测方法。设计针对李斯特菌特异性基因的引物，提取病料中的DNA作为模板，进行PCR扩增。扩增产物经电泳检测，若出现特异性条带，则表明样本中存在李斯特菌。PCR技术具有敏感性高、特异性强、检测速度快等优点，可用于早期诊断和疫情监测。

-核酸探针技术：用标记的核酸探针与病料中的李斯特菌核酸进行杂交，通过检测杂交信号来确定样本中是否存在李斯特菌。该技术特异性强，但操作相对复杂，成本较高。

鉴别诊断

羊李斯特菌病需要与其他一些具有类似症状的疾病进行鉴别。

-羊传