二代测序文库构建流程.pptx
二代测序文库构建流程
演讲人：
日期:
06
质检与定量分析
目录
01
样本处理与质检
02
核酸片段化处理
03
末端修复与加A
04
接头连接与纯化
05
文库扩增优化
01
样本处理与质检
样本类型与浓度要求
样本类型
包括但不限于血液、组织、细胞、唾液、尿液等，需根据实验需求选择适当样本类型。
样本浓度
对于不同样本类型，其浓度要求有所不同，需保证样本浓度在适宜范围内，以保证后续实验操作的顺利进行。
核酸质量评估标准
完整性
通过电泳等方法检测核酸的完整性，确保核酸无明显降解或断裂。
纯度
浓度
核酸样品需无蛋白质、多糖、盐类等杂质污染，可通过紫外分光光度计检测A260/A280比值来评估。
需准确测定核酸浓度，以保证后续实验步骤的精确性。
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2
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去除杂质
选用合适的核酸纯化方法，如柱式纯化、磁珠纯化等，以保证核酸的纯度和完整性。
核酸纯化
核酸片段化
对于长链核酸，需进行片段化处理，使其长度适合测序要求。
根据样本类型和实验需求，采用合适的预处理方法去除样本中的杂质，如蛋白质、多糖等。
预处理与纯化方法
02
核酸片段化处理
超声波破碎法
利用超声波产生的机械力使DNA分子随机断裂，形成一定长度的片段。
片段化方法选择
酶切法
利用特定的限制性内切酶对DNA进行切割，获得特定大小的片段。
物理方法
如喷雾法、激光法等，通过物理方式将DNA分子断裂为片段。
片段大小控制标准
根据测序平台的要求，选择合适的片段大小范围。
片段大小范围
要求片段大小分布均匀，避免过大或过小的片段。
片段大小分布
要求片段末端为平末端或粘性末端，以满足测序需要。
片段末端修饰
设备参数优化方案
超声波破碎仪
调整功率、时间、温度等参数，以获得合适的片段大小和分布。
酶切反应体系
优化酶的种类、浓度、反应时间等条件，提高酶切效率和片段回收率。
片段分离技术
如电泳、磁珠分离等，选择适当的分离技术，确保片段的纯度和回收率。
03
末端修复与加A
利用DNA聚合酶的活性，将DNA片段的5端或3端突出的部分补齐，使DNA末端变为平齐的。
末端修复反应原理
填补不平齐的DNA末端
在DNA双链中存在缺口的地方，利用DNA聚合酶的活性，将脱氧核苷酸填入缺口中，使DNA双链完整。
填补缺口
在DNA片段的5端加上一个磷酸基团，以便后续的连接反应。
5端磷酸化
反应温度
加A尾反应通常在一定的温度下进行，以保证酶活性。
反应时间
反应时间的长短会影响加A尾的效率，时间过长可能导致DNA片段自连。
DNA片段浓度
DNA片段的浓度也会影响加A尾的效率，浓度过高或过低都不利于反应的进行。
酶的种类和活性
加A尾反应需要特定的酶催化，酶的种类和活性对反应效率有很大影响。
加A尾反应条件
缓冲液体系优化
pH值
缓冲液的pH值对酶活性有很大影响，需要调节到最适pH值。
盐浓度
盐浓度过高或过低都会影响酶的活性，需要优化盐浓度。
离子种类
一些离子对酶活性有激活或抑制作用，需要优化离子种类和浓度。
添加剂
一些添加剂可以提高酶的稳定性或活性，需要优化添加剂的种类和浓度。
04
接头连接与纯化
Y型接头
叉形接头
通用接头
序列特异性接头
适用于双链DNA片段，连接效率高，但连接位置不可控。
根据目标序列设计接头，特异性强，但制备成本较高。
适用于单链DNA片段，连接位置可控，但连接效率较低。
适用于多种DNA片段，制备简单，但连接效率相对较低。
接头类型与适配策略
接头浓度
接头浓度过高会导致自连，过低则连接效率低。
连接效率影响因素
01
DNA片段长度
DNA片段过长或过短都会影响连接效率。
02
连接温度与时间
温度过高或时间过长会导致非特异性连接，过低或时间过短则连接效率低。
03
离子强度与pH值
适宜的离子强度和pH值能提高连接效率。
04
操作简便，但分辨率较低，可能损失目标片段。
磁珠纯化
适用于大规模样本，但纯度较低，可能有杂质残留。
柱纯化
01
02
03
04
分辨率高，但操作繁琐，耗时长。
凝胶电泳
操作简便，纯化效率高，但成本较高。
试剂盒纯化
纯化方法对比
05
文库扩增优化
PCR引物设计原则
长度和GC含量
引物长度通常在18-25个碱基之间，GC含量保持在40%-60%，以保证引物的稳定性和特异性。
避免引物二聚体
引物特异性
引物自身或引物之间应避免形成二级结构，如发夹结构、二聚体等。
引物应与目标序列高度特异，尽量避免与非目标序列结合。
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3
扩增循环数确定
扩增效率
扩增循环数应保证PCR扩增效率，使得目标序列得到足够扩增，同时避免非特异性扩增。
扩增产物量
扩增循环数增加，扩增产物量呈指数增长，但过多的循环数会导致PCR反应进入平台期，扩增效率降低。
实验条件
扩增循环数的确定还需考虑实验条件，如模板浓度、