一种基于高分辨液质联用仪的13C标记葡萄糖同位素丰度检测方法.docx

背景介绍

自上世纪80年代提出人类基因组计划以来，研究者们开启了对生物学、生物信息学等生命科学领域的研究探索。[U-13C6]葡萄糖作为示踪剂，可示踪糖酵解、三羧酸循环、谷氨酰胺代谢等与肿瘤发生密切相关的关键代谢通路，是目前应用最为广泛的稳定同位素试剂。[U-13C6]葡萄糖同位素丰度值是否准确对于同位素示踪及后续的代谢流量计算都会产生较大影响，因此，准确、稳定的测定葡萄糖的13C丰度值十分重要。

本文亮点

1、采用高分辨质谱仪结合液相色谱，通过考察检测适用条件、样品浓度、质谱扫描次数及流动相干扰影响等方面建立13C标记葡萄糖同位素丰度检测方法，并对不同丰度的13C标记葡萄糖样品进行丰度测定；

2、该方法无需复杂的前处理过程，具有较好的准确性和稳定性，是一种具有潜力的同位素试剂质量控制方法。

内容介绍

1实验部分

1.1?主要仪器与试剂

1.2?实验方法

1.2.1?标准溶液配制

称取适量[U-13C6]葡萄糖，加入50%乙腈水溶液涡旋30s充分混匀，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。准确移取适量储备液，用50%乙腈水溶液稀释成250ng/mL以及1、5、10、50、100μg/mL的工作标准溶液。储备液和工作标准溶液均保存于4℃。

1.2.2?不同?13C丰度葡萄糖溶液配制

称取适量[1,2-13C2]葡萄糖,加入50%乙腈水溶液涡旋30s充分混匀，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。不同13C丰度葡萄糖样品由[U-13C6]葡萄糖溶液与[1,2-13C2]葡萄糖溶液混合制成。准确移取75μL[1,2-13C2]葡萄糖储备液和25μL[U-13C6]葡萄糖储备液，用50%乙腈水溶液稀释成100μg/mL的样品溶液Ⅰ。准确移取50μL[1,2-13C2]葡萄糖储备液和50μL[U-13C6]葡萄糖储备液，用50%乙腈水溶液稀释成100μg/mL的样品溶液Ⅱ。准确移取25μL[1,2-13C2]葡萄糖储备液和75μL[U-13C6]葡萄糖储备液，用50%乙腈水溶液稀释成100μg/mL的样品溶液Ⅲ。储备液和样品溶液均保存于4℃。

2结果与讨论

2.1?13C标记葡萄糖同位素丰度计算

本文采用液相色谱-高分辨质谱联用法对[U-13C6]葡萄糖同位素丰度进行测定，图1a为葡萄糖的提取离子流图，提取出峰窗口叠加质谱图中的各同位素标记模式的峰强度(图1b)。

2.2?高分辨质谱仪用于葡萄糖13C丰度计算的适用条件[U-13C6]

葡萄糖样品中可能含有多种13C标记形式的化合物，如13C1-葡萄糖、13C2-葡萄糖等，因此在质谱ESI-条件下也会有相应[13C1C5H12O6-H]-、[13C2C4H12O6-H]-等一系列的分子离子峰，且各化合物自身天然同位素丰度也可能会造成干扰。

2.3?[U-13C6]葡萄糖同位素丰度结果影响因素

2.3.1?样品浓度

由于葡萄糖在质谱检测上存在离子化效率低等特点，当[U-13C6]葡萄糖样品浓度过低时，部分13C标记模式无法检出而造成同位素丰度结果存在偏差，同位素丰度结果如图2所示。

2.3.2?质谱图张数

2.3.3?流动相背景干扰

2.4?方法应用

应用本研究所建立的方法对3种不同丰度的13C标记葡萄糖样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行13C丰度测量，对样品出峰时间窗口内所有质谱图进行叠加分析并扣除流动相背景，其检测结果如表5所示。

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3结论

本文建立了基于高分辨液质联用仪的13C-葡萄糖同位素丰度计算方法，该方法具有良好的准确性，精密度优于0.15%，并且所需样品用量少，无需进行衍生化等前处理。此外，本方法将色谱的分离富集与高分辨质谱检测的高精度相结合，可用于多种化合物同位素丰度的同时测定，克服了传统方法上采用流动注射进样方法的局限性，具有良好的应用前景。