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解聚复肾宁对糖尿病肾病大鼠肾保护作用机制的研究
导语:本研究观察解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾组织肿瘤坏死因子-
α、单核细胞趋化蛋白-1和血清TNF-
α的影响,探讨其肾保护作用机制。由本站硕士论文中心整理。
前言
糖尿病肾病(diabeticnephropat勿,DN)是糖尿病
(diabetesmellitus,DM)严重的微血管并发症之一,其发病机制尚未完全
阐明。近年认为,DN是一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病I’]。许多动物
实验及临床资料均提示DN除了糖、脂代谢紊乱,血流动力学异常外,往往
还存在细胞因子、炎症介质水平上升和炎性细胞浸润,故炎症可能单独或
作为上述机制的下游环节,在DM肾损害中起一定作用。肿瘤坏死因子一a(
TNF一a)和单核细胞趋化蛋白一1(MCP一l)是参与DN的两个重要炎症介质[4
,5]。DM状态下,高糖、血流动力学障碍等均可损伤肾脏固有细胞,肾脏
固有细胞在病理状态下可以产生TNF一a、白细胞介素一1(IL一1)、白细胞
介素一6(IL一6)、一氧化氮(NO)等多种炎症因子,这些因子又通过自分泌
和旁分泌方式使炎症效应不断扩大,引起炎症级联反应。
本研究旨在用临床上治疗DN疗效较好的中药复方制剂解聚复肾宁(JJ
FSN)干预STZ诱导的糖尿病大鼠,观察其对DM大鼠肾组织下NF一a、MCP一1
表达及血清TNF一a的作用,探讨其肾保护作用的机制。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1实验动物
8周龄健康雄性sD大鼠55只,体重180一2209,由重庆医科大学实验
动物中心提供。LLZ主要仪器MDF一
382E型一80超低温冰箱OlymPus一BHZ光学显微镜HH一W21一600电热恒温水
箱强生稳豪型血糖测定仪TL一05型离心机DFM一%型多管放射免疫计数器H
一7500透射电镜日本三洋公司日本OlymPus公司上海医用恒温设备厂美国
强生公司北京恒大建海科贸公司众成机电技术公司日本日立公司LL3主要
试剂解聚复肾宁(J开SN)由黄茂、黄答、葛根、川芍、丹参、当归、黄连
、姜黄等13味中药制备而成,原药购自重庆桐君阁药房,符合国家药典标
准,经重庆医科大学中医药学院中药教研室鉴定并制备成浓缩口服液,含
生药29/nil。链脉佐菌素美国Sigma公司厄贝沙坦杭州赛诺菲安万特民生
制药有限公司抗TNF一a、MCP一1兔多克隆抗体武汉博士德公司免疫组化即
用型SABC试剂盒(H抗)武汉博士德公司DAB显色剂北京中杉金桥有限公司TN
F一a放免试剂盒北京普尔伟业生物有限公司
1.2方法主要试剂
1.2.l配制方法
(l)0.IM构椽酸一构椽酸钠缓冲液(pH4.2):l)准确称取构椽酸(C6HsO
7一HZO)21.0149,加入双蒸水至1000ml,配成
0.1mol/l溶液;构椽酸钠(Na3H5o7.HZO)29.4119,加双蒸水1000ml配成0.l
moFI溶3)取54.onil0.lmol/l构椽酸溶液,
46.0ml0.lmol/l构椽酸钠溶液混匀即可。(2)10%水合氯醛配制109水合氯
醛溶于looml的蒸馏水中即成。
(3)4%多聚甲醛溶液:40gPFA溶于装有50Oml蒸馏水容器内,持续加热
至60一65℃,制备成乳白色悬液,用NaOH(IM)调PH值至7.0,溶液呈清亮
状;再加入约50OnilZxPBS,充分混匀,再次测定PH值,过滤后定容至
1ooomL,4℃保存备用。
(4)o.olM,pH7.4磷酸盐缓冲液(pBS)配制
:NaHZpO4.2HZO0.899,N处HPO4.12H208.79,
NaCI22.89,加蒸馏水300Oml,pH试纸测定PH值7.4。
(5)伊红染液:伊红1.09,蒸馏水99nil。
(6)多聚赖氨酸溶液的配制取多聚赖氨酸原液5ml,加蒸馏水40nil,
配制成1:8的多聚赖氨酸溶液,即可用于处理载玻片。
(7)0.50,0高碘酸:高碘酸0.59,加蒸馏水至loonil,40e保存备用
。
(8)0.5%偏重亚硫酸钠:偏重亚硫酸钠0.59,加蒸馏水至looml,40c
保存备用。
(9)schiff液的配制:碱性品红lg,IN盐酸20nil,偏重亚硫酸钠lg,
蒸馏水200ml。将Zooml蒸馏水煮沸,冷却至900c,加入碱性品