DB22_T2911-2018_贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法_吉林省.docx
ICS67.120.30
DB22
B50
吉林省地方标准
DB22/T2911—2018
贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法
DeterminationofVibrioParahemolyticusinshellfish-dropletdigitalPCRmethod
吉林省市场监督管理厅
发布
DB22/T2911—2018
前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。
本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局提出并归口）。
本标准起草单位：长春海关（原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心）、吉林大学中日联谊医院、
吉林农业大学。
本标准主要起草人：聂丹丹、聂海英、王宁宁、杜佳剑、曲辉、彭勃、王玮琳、刘金华、罗雁非、
洪晓坤。
I
DB22/T2911—2018
贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法
警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问
题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。
1范围
本标准规定了贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步
骤和试验数据处理与防止污染措施。
本标准适用于贝类中副溶血性弧菌检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB4789.1-2016食品安全国家标准食品卫生微生物检验总则
GB4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据副溶血性弧菌的旋转酶
（gyrase）特异性基因序列对贝类中副溶血性弧菌进行鉴定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性
微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对副溶血性弧菌的快速定性检测。
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T668中二级水的要求。
4.1裂解液,成分包括：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100
mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L
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4.770%乙醇。
4.8
2×ddPCR预混液。
4.9副溶血性弧菌旋转酶（gyrase）基因引物和探针
4.10上游引物：5’-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-3’
下游引物：5’-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3’
探针：5’-（FAM）-ATCCATCGTGGCGGTCATATCCAC-（TAMRA）-3’
4.11菌株：副溶血性弧菌阳性标准菌株。
5仪器和设备
5.1微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～
200μL，100μL～1000μL。
5.2高速冷冻离心机(12000r/min)。
5.3涡旋混合器。
5.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
5.5微滴生成仪。
5.6PCR仪。
5.7微滴读数系统。
6样品
7.2.1用移液器（5.1）吸取副溶血性弧菌增菌液1mL，加到1.5mL无菌离心管中，12000r/min
离心（5.2）10min，吸弃上清；加入50μLDNA裂解液（4.1），混匀（5.3）后沸水浴5min，12000
r/min离心5min。取上清保存于-20℃备用。
7.2.2按照GB/T19495.3的规定进行CTAB提取法制备模板DNA（4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7），
或使用商业化的DNA提取试剂盒时按照其说明书操作。
按照GB/T19495.3的规定，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（5.4）260nm和280nm的测定
核酸含量，用双蒸水稀释至1ng/μL～100ng/μL备用。
2
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表1微滴数字PCR反应体系
体积
μL
10
1
试剂成分
2×ddPCR预混液(4.8)
上游引物（10μmol/L）（4.9）
下