DB51T 1549-2012 樱桃致死黄化病PCR检验鉴定方法.docx

ICS

DB51

四川省地方标准DB51/T1549—2012

樱桃致死黄化病PCR检验鉴定方法

2012-12-20发布2013-03-01实施

四川省质量技术监督局发布

I

DB51/XXXXX—2012

目次

前言 II

1范围 1

2原理 1

3试剂和材料 1

4仪器及用具 2

5田间取样 2

6实验室检验 3

7结果判定与记录 4

8样品处理 4

附录A(资料性附录)樱桃致死黄化病基本信息 5

DB51/XXXXX—2012

IⅡ

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则进行编写。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

本标准由四川省农业厅提出并归口。

本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。

本标准主要起草人：万佳、宁红、谢成伦、蒋辉、吴志平、郭迪金、陈素清、余坚志、肖连康、朱国翱。

本标准系首次发布。

DB51/XXXXX—2012

1

樱桃致死黄化病PCR检验鉴定方法

1范围

本标准规定了樱桃致死黄化病的PCR检验鉴定方法。

本标准适用于樱桃、桃树等植物的樱桃致死黄化病的PCR检验鉴定。

2原理

樱桃致死黄化病(CherryLethalYellowsphytoplasma,CLYphytoplasma)是由植原体侵染引起的病害，主要分布于植物韧皮部筛管细胞、伴胞、韧皮纤维等。该病害通过接穗和苗木远距离传播，是樱桃、桃树等植物上的重要病害之一。引起樱桃致死黄化病的植原体根据16SrDNA基因序列划分为榆树黄化组(16SrV),PCR方法是检测该植原体的有效方法之一，可以快速进行樱桃致死黄化病检验鉴定。

3试剂和材料

除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。试剂和材料包括：

——灭菌超纯水(ddH?O)。—---液氮(N?)。

—研磨液(Grinding

buffer)4.1gKH?PO?,21.7gK?HPO?,100g蔗糖，1.5gBSA,20gPVP-10,

1000mlH?O。

——Tris液[1M](Tris-HCl

buffer)称取12.14gTris试剂，加蒸馏水1L搅拌至溶解，高压灭菌

保存。

—EDTA液[1M](EDTA

solution)称取37.224gEDTA试剂，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，边搅

拌边加入NaOH,调pH值至8.0,加热溶解至澄清，定容1L后高压灭菌保存。

——SDS液[10%](SDSsolution)称取20gSDS粉末，加蒸馏水200ml在68℃溶解。

—DNA提取液(DNAextrationbuffer)取Tris液10ml,EDTA液40ml,SDS液10ml,加热搅拌至70℃混合均匀，调pH=8.0,高压灭菌后室温保存。

——蛋白酶K液[10μg/μl](ProteinaseK-Solution)称取5mg蛋白酶K,加入500μl无菌超纯水

水混合均匀，-20℃保存。

——十二烷基肌氨酸钠[10%](N-Lauroylsarcosinesodiumsalt)称取1g十二烷基肌氨酸钠，加入

10ml蒸馏水溶解。——异丙醇(C?H?O)。

——TE缓冲液(TEbuffer)1MTris-HClBuffer5ml,1MEDTA2ml,将溶液定容到500ml后，高压灭菌后室温保存。

——NaCI[5M]称取292.5gNaCl,溶解并定容至1L。

—CTAB/NaCl溶液(CTAB/NaClbuffer)4.1gNaCl溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB,加热溶解后定容至100ml。

2

DB51/XXXXX—2012

——苯酚(C?H?O)。——氯仿(CHCl?)。

—-异戊醇(C?H??O)。——乙醇(C?H?OH)。

—PCR混合缓冲液(PCRMixbuffer)含dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、缓冲液。

——植原体通用引物(Primers)。利用已报道的植原体16SrDNA和16S-23