信号通路在FSH促进卵巢癌细胞增殖侵袭中作用.doc

信号通路在FSH促进卵巢癌细胞增殖与侵袭中的作用 卵巢癌发病机制的研究一直是妇科肿瘤学界关注的热点。近年来的研究表明,卵巢癌的发生和进展与其所处的激素环境有关:绝经、排卵多或不孕治疗时过量卵泡刺激素(FSH)刺激可能是卵巢癌发生的重要危险因素。多项研究显示,FSH通过作用于细胞表面H受体(HR)激活细胞内信号传导通路而发挥作用,但其具体作用机制尚不清楚:本研究主要探讨H是否通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路调节核因子κB(NF-κB)的活性,而促进卵巢癌细胞增殖和侵袭,为卵巢癌的发病机制和基因治疗提供实验依据。 材料与方法 一、材料来源 卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOⅥ为北京大学人民医院妇科实验室惠赠;卵巢黏液性囊腺癌细胞株3A0为河北医科大学第四医院实验中心惠赠。注射用重组人FSH为瑞士Laboratorc serrono SA公司产品;PI3Κ抑制剂一LY294002购自美国Pｒｏｍｅｇａ公司。兔抗人FSHR、Akt1/2抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人磷酸化Akt(pˉAkt)、NF-κB p65抗体购自美国Santa Cruz公司;核蛋白抽提试剂盒购自上海捷瑞生物技术有限公司。 二、方法 I,细胞培养:SKOⅤ3、3A0细胞接种于含有10%胎牛血清、100U/llll青霉素、100U/ml链霉素的RPMH 1640培养基中,置于37℃、饱和湿度、5%C02培养箱中培养,取对数生长期的SKOⅤ3、3A0细胞用于以下实验,实验分为4组,即对照组、H红】、LY294002组禾口FSH+LY294002组(LY294002处理30min后加入鸭H)。H组以佃U/L的FSH Qlx理SK0Ⅴ348h、3A0细期包24h;LY294002组以10umol/L的LY29硐02处理SKOV~s细胞48h、3A0细胞24h;FSH+LY294oo2组以10umol/L的LY294002处理30min,再加入们U/L的FSH继续列3里SKOⅤ3细胞48h、3A0细胞24h。 2.四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度H处理不同时间后SKOⅦ、3A0细胞的增殖情况:取对数生长期SKOⅤ3、3AO细胞,胰酶消化后,调整细胞密度为1×105个/lnl,每孔100耐接种于%孔板,培养6~8h,待细胞贴壁后,换为含不同浓度(分别为10、20、40、80、I60U/L)FSH的RPMI1640培养基将SKOⅤ3、3AO细胞制成单细胞悬液,按1×105/ml接种于96孔板,均设置5个复孔,置于37℃、饱和湿度、5%Co2培养箱中分别培养12、叨、48、72h,每孔加人四甲基偶氮唑蓝(MTT)液10μl、磷酸盐缓冲液(PBS)⒇△l,继续培养4h,加入1OOμ10%十二烷基硫酸钠(SDs),继续孵育4h,置全自动酶标仪于570nm处测定各孔吸光度值,以不加细胞孔作为空白对照,0U/L的H处理孔作为相应细胞的对照,计算细胞增殖率,细胞增殖率(%)=(AFⅢ-A空白瑚贾)/(A对照^⒕空白对照)×1OO%。实验重复3次,取均值。 　　3.倒置显微镜观察各组SKOV~s、3A0细胞的形态:取对数生长期的SKOⅤ3、3AO细胞接种于放有盖玻片的培养皿中培养,按对照组、H组、LY294002组和H+Π294002组的相应方法处理,倒置显微镜观察各组细胞的形态。 　　4.体外侵袭实验检测各组sKOⅤ3、3AO细胞的侵袭能力:用50mg/L人工基底膜基质凝胶(matrigel,按⒈8稀释)包被穿膜(transwe11)小室底部膜的上室面,每孔100淤,37℃放置2h,置室温紫外线照射过夜千燥,风干的matri叩1胶加37℃无血清培养基再水化。在预包被的tran洲e11小室中每孔加人细胞悬液⒛0ul(含2×104个细胞),下室加人RPMI1bZI0培养基500耐,37℃、5%C02培养箱培养,待细胞贴壁后,按各组的相应方法处理48h。擦去transWe11小室上面未穿过的细胞,风千后用0,1%结晶紫染色30min,镜下(×100)计数10个不同视野中的穿膜细胞数。实验重复3次,取均值: 　　5蛋白印迹法检测各组SKOⅤ3、3AO细胞中HR、Akt1”、pˉAkt、NF κB蛋白的表达:PBS冲洗细胞2次,加入适量的蛋白裂解液,冰浴裂解30血n;4℃12000min离心⒛min,取上清液,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,分装后-70℃冻存各用。采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离蛋白,水浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭1h,一抗4℃孵育过夜,三羟基氨基甲烷-枸橼酸盐缓冲液(TTBS)洗膜后,加人辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔坨G二抗,37℃孵育