几种生物新技术的研究进展【参考】.doc

三种生物新技术在微生物研究中的应用进展 摘 要：本文对几种时下比较热门的生物技术的应用原理、存在的问题和研究进展进行了简单阐述，并且结合自己研究的领域，浅析了这些新兴的生物技术在生物防治真菌中研究的实际应用。 关键词：微生物新技术；基因编辑技术； RNA 干扰技术； DNA 芯片技术 近年来，随着生物技术突破性的变革及科学家们不断的努力，新的基因编辑技术不断涌现出来，出现了当下最热门最新型的 CRISPR/Cas9 基因编辑系统。近日，中国科学家利用该基因编辑技术对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定 DNA 片段的敲除、加入等。而 CRISPR/Cas9 技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。 1. CRISPR/Cas9 基因编辑技术概述 CRISPR/Cas9 基因编辑技术是最近几年出现的一种由 RNA 指导 Cas 核酸酶对靶向基因进行特定 DNA 修饰的技术。它是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA ，从而实现对基因组 DNA 序列进行编辑；而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的 gRNA (guide RNA)，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。作为一种 RNA导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子 (unifying factor)，它能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9(Cas9 nuclease-null) 融合，并表达适当的 gRNA，即可靶定任何 dsDNA 序列，而 RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响 Cas9 的结合。因此， Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA， 这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。 2. CRISPR/Cas系统的灵感来源 CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（成簇的规律间隔的短回文重复序列）。 首先，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（原间隔序列临近基序），当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。 然后，当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。 3. CRISPR/Cas9存在的问题 Cas9 酶是基因编辑系统中一个非常关键的组成部分，而脱靶效应一直是 CRISPR 技术需要克服的重大技术问题。在任何临床应用之前，医生和监管机构必须确保 Cas9 酶不会引起非目标基因组的损伤。11月30日，发表在《科学》杂志上的一项研究中，麻省理工学院-哈佛医学院 Broad 研究所的研究小组又取得了一项突破性的成果。研究人员通过创建了3个新版本的 Cas9 酶大大降低了CRISPR/Cas