微生物分子生态报告讲解.ppt

微生物分子生态学的部分研究方法报告; 分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制的科学。它是生态学与分子生物学相互渗透的形成的一门新兴交叉学科，其研究内容包括种群在分子水平的遗传多样性及遗传结构，生物器官变异的分子机制，生物体内有机大分子对环境因子变化的响应，生物大分子结构、功能演变与环境长期变化的关系以及其他生命层次生态现象的分子机理等。 ; 微生物群落结构和多样性是微生物生态学 研究的热点内容;20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。;可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。 采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少 （不到1 % ）。 Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物区系组成状况，烦琐、耗时。;培养条件 营养限制 失去生态位 ;2、群落水平生理学指纹方法(CLPP);3、生物标记物法（Biomakers ）;醌指纹法(Quinones Profiling);磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。; PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态变化,能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂肪酸,但是也有其局限性。 第一,他不能从种的水品上鉴定微生物,只能鉴定到属; 第二,这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸,标记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计,因此操作过程需要十分谨慎,防止人为因素的干扰。 第三,细菌和真菌在不同的生长时期以及环境压力下的脂肪酸含量有所变化,给监测带来困难。 另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。;4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR指纹图谱技术;在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERIC-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。;5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法;ARDRA分型与测序;变性梯度凝胶电泳（DGGE）;原理;显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。;不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。;然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。;当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。;; 环境样品的核酸提取在土壤微生物生态中非常重要。最初采用的方法主要是剧烈的机械打碎以及超声波破碎细胞。但是这种方法得到的DNA片断一般在5K~10K大小,不适合作微生物的群落分析。微生物细胞与环境中的土壤颗粒、粘土以及有机物接合紧密,这对高效率提取核酸造成了很大的困难。同时,腐植酸对DNA的检测和定量也有很大的影响,主要表现在抑制DNA高温聚合酶的活性,干扰限制酶的位点识别,降低转化效率以及DNA杂交的特异性。Jizhong Zhou等人研究了各种提取方法,他们将土壤样品DNA提取分为细胞裂解粗提DNA和纯化两个步骤,并将几种方法进行比较,建立了一种对大多数土壤样品简单、快速、高效的基于SDS的提取方法。很多实验表明,现在能够从土壤样品中提取出超过90%的rDNA;基于PCR技术的方法也存在着不足: ①环境样品在提取核酸前的厌氧或室温存放不可避免的导致其样品中微生物的变化,冷冻可以减缓变化,但是不能存放时间过长,真菌在0~4摄氏度仍可以观察到明显的生长现象。 ②每次提取DNA的效率不同,造成结果重复性差。