2 发酵工程的菌种及其扩大培养.ppt

第二章 发酵工程的菌种及其扩大培养 定义：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。 这些纯种的培养物称为种子。 种子必须具备的条件： ①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐 中能迅速生长 ②生理性状稳定 ③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要 求 ④无杂菌污染（不带杂菌） ⑤生产能力稳定 详见教材P12。 第一节 发酵工程菌种的分离和筛选 一、菌种的来源 向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 目前发现的抗生素的生物来源如下： （三）霉菌（mould） 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。 定方案：首先要查资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。 采样、筛选流程详见教材P13图2-1 在这个流程中各个步骤经常采用的方法、思路以及注意事项如下： （一）采 样 1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 （二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。 富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。 1、液体富集培养 2、固体富集培养 详见教材P14-15 （三）培养分离要解决的问题 1、“分离什么和从哪里分离出?” 2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。 3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。 从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。 到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。 在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。 因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 (四)分离和筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型 发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就