烟草品种鉴定SNP标记法-技术报告.docx

PAGE22

《烟草品种鉴定技术规程

SNP标记法》

行业标准技术报告

项目组

2023年2月

1概述

烟草（NicotianaTabacum）是一种重要的经济作物，在我国国民经济生产中占有重要地位。我国迄今为止育成（通过审定）的烤烟品种有180多个，现存的各类烟草种质资源5000余份，数量居世界之最。但是在烟草品种和种质资源的鉴定和应用等方面与主要粮食作物相比还存在很大差距，尤其是DNA身份鉴定领域缺乏相应的检测标准。2015年，制订了《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烟草》（NY/T2746-2015），建立了基于品种特异性、一致性和稳定性（DUS）的形态学评价鉴定体系。虽然形态学鉴定法简单、直观，但是该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多（鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等）、周期长（跨越烟草不同生育期）、鉴别难度大（性状指标差异小）、同一性状年度间存在差异（受环境影响）等不足，同时鉴定结果还具有一定的主观性。此外，由于亲本的集中利用和定向人工选择造成我国烟草品种遗传背景狭窄[1]，形态学鉴定难以区分微小的遗传变异。

作物品种差异，本质上是品种的基因型差异决定的。DNA分子标记指纹图谱鉴定法通过直接分析品种DNA水平上的差异来进行品种鉴定，能够将烟草品种的鉴定由传统的形态学鉴定提升到DNA分子鉴定水平。DNA分子标记指纹图谱鉴定法通过直接分析品种DNA水平上的差异来进行品种鉴定，与形态学鉴定相比，具有多位点性、高多态性、简单而稳定的遗传特性，表现出极大的实用价值。研究人员先后尝试利用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)[2]、SSR(SimpleSequenceRepeats)[3-5]和ISSR(Inter．simpleSequenceRepeats)[6]等分子标记进行烟草DNA指纹图谱构建。由于烟草基因组自身的复杂性和低遗传多样性的特点，加之这些标记技术存在的局限性如标记数量少、检测通量低、精确性低、自动化程度低、标记开发难度大等，限制了其进一步的发展与应用[7]。SNP(singlenucleotidepolymorphisms)是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性[8]。栽培烟草基因组大小约为4.5G，其中含有大量的重复序列，并且品种间遗传多样性低[7,9]。作为第三代分子标记，SNP相较之前的标记具有以下优势：1）精确性高，区分的差异是单个碱基的差异，数据重复率高；2）高通量，可以同时对成百上千的位点进行检测；3）覆盖广，SNP在基因组中广泛分布，极易筛选到分布于各染色体上的标记；4）自动化程度高，检测流程高度集成化、标准化，节约了人力物力，减少了人为读带误差导致的干扰[10]。目前，国际植物新品种保护联盟（UPOV）、国际种子检验协会（ISTA）、国际种子联盟（ISF）等国际组织均将SNP标记作为品种身份鉴定和数据库构建的优选标记。2015年农业部出台了《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》，同样提出以SNP技术和现代信息技术为手段，构建全国统一的农作物品种DNA信息数据库及品种身份查询平台。

SNP芯片(singlenucleotidepolymorphismarray)是将数百万DNA标记序列有规律地排列在玻片或特殊硅片上，固定形成SNP探针阵列。它的工作原理是通过固定在芯片上的SNP标记序列与目标基因组发生碱基配对反应，从而精准鉴定基因信息。与计算机芯片高度微型技术集成特点相似，基因芯片运用先进的微生化反应技术、显微标记技术、微米级扫描分辨成像技术和生物信息计算机处理技术，准确鉴定检测生物个体中特定的DNA序列[11]。SNP芯片通过芯片上的SNP探针检测生物个体中大量的SNP变异位点，从而可以推测基因组的基因型和关键的遗传变异。目前，已有超过25种作物和多年生树木开发了超过50种SNP芯片[12]。康奈尔大学利用AffymetrixGeneChipRice44KSNP芯片针对413份水稻品种进行基因分型和鉴定[13]。北京市农林科学院玉米研究中心利用3072个SNP标记成功研发了maizeSNP3072芯片，可以有效应用于玉米品种指纹图谱鉴定[14]。中国种子集团有限公司联合北京大学、华中农业大学与美国Illumina公司利用第二代SNP芯片技术率先成功研制出水稻全基因组育种芯片系列Rice6K、Rice60K等[11]。Rice6K在粳稻之间、籼稻之间、籼稻和粳稻之间任意两个品种能够检测到的多态性SNP位点平均分别约为800、1000和2600个[15]。Rice60K芯片对粳稻之间、籼稻之间、籼稻和粳稻之间任意两个品种能够检测到的多态性SNP