乳胶凝集试验快速检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的研究.pdf

1 doi：10．16372／j．issn．1004—6364．2017．06．01 乳胶凝集试验快速检测肠出血性 1 大肠杆菌057：H7的研究 罗玲，罗青平，温国元，王红琳，汪宏才，张腾飞，艾地云，卢琴，张蓉蓉，邵华斌+ (湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室， 动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉430064) 摘要：通过将羧化聚苯乙烯乳胶与大肠杆菌0157：H7Intimin蛋白单克隆抗体进行偶联， 对最佳偶联抗体IgG量、最佳偶联时间等条件进行优化，建立了快速检测大肠杆菌0157：H7的 乳胶凝集试验方法。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异、简便等优点，适于临床应用，为大 肠杆菌0157：H7的快速诊断提供了技术支撑。 关键词：大肠杆菌0157：H7；单克隆抗体；乳胶凝集 中图分类号：$855．1 文献标识码：A 肠出血性大肠杆菌0157：H7是一种重要的食泛用于临床检测。 源性病原菌，是当今世界上不断增多的食品安全 1材料与方法 和突发性公共卫生事件的主要诱因之一…。该菌 1．1材料 能感染禽类和其它动物，人主要通过污染的食物 1．1．1试验菌株 感染陉]。发展快速、敏感、特异的检测方法和试剂 购于北京北纳创联生物技术研究院；鸡大肠杆菌 是确保饮水和食品安全、预防大肠杆菌0157：H7 感染发生的重要手段。目前，国内外已报道的检 测方法有多重PCR、基因芯片、噬菌体分型、脉冲标准菌株以及沙门菌(CVCC533)、禽巴氏杆菌 场凝胶电泳分析、生物传感器等，这些方法在检测 (CVCC2082)等标准菌株购自中国兽医药品监察所。 方面各有所长，但大多对仪器设备要求较高口“3， 1．1．2试验动物 使用范围有很大的局限性。分离鉴定仍是检测大 6—8周龄BALB／c小鼠购自湖北省实验动物研 肠杆菌0157：H7的金标准，但其通常需要数天才究中心。 能得到结果，不能满足快速诊断的要求。在大肠 1．1．3主要试剂 杆菌0157：H7的免疫学检测方法中，所用抗体多 山梨醇麦康凯琼脂(sMAc)、改良EC肉汤 为多克隆抗体，抗0157：H7的多克隆抗体与抗其(mEC+n)购于北京北纳创联生物技术研究院；0．25％ 它肠道细菌的抗体存在着严重交叉反应，通常的 胰蛋白酶、双抗、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、 纯化不能满足精确的血清学检验需求，而以单克 胎牛血清、RPMI一1640培养基购自Gibco公司。 隆抗体为基础建立的抗原检测方法和试剂国内外 1．2方法 少有报道。本研究建立了以单克隆抗体为基础的 1．2．1抗Intimin蛋白单克隆抗体的制备 Intimin 从已经建株的5株杂交瘤细胞n1中筛选1株抗 乳胶凝集方法来检测大肠杆菌0157：H7 蛋白。该方法操作简捷，适合现场快速检测，可广 体效价高、特异性强的杂交瘤细胞扩大培养，在 收稿日期：2016—11-02；修回日期：2017一01—20 项目(2015ABA039)；湖北省农业科技创新中心项目(2017—620—004—001) 作者简介：罗ff(1978一)，女，硕士，副研究员，主要从事禽病防控方面的研究，E-mail：luoling__1978@126．tom． 4通讯作者：邵华斌(1961一)，男，研究员，主要从事预防兽医学研究，E—mail：shhbl961@163．corn ——49—— 万方数据 BALB／c小鼠体内诱生腹水生产单克隆抗体，用间1．2．4乳胶凝集试验 1．2．4．1 接ELISA方法测定收集的每只小鼠腹水效价，将 自凝性检验 效价不低于1：(1000x2“)的腹水进行混合，并将 用等量的PBS、生理盐水、蒸馏水等分别代替 混合后的腹水进行效价和亚型鉴定。 待检抗原按上述最佳条件和程序进行反应，观察