【2017年整理】免疫标记技术.ppt

免疫标记技术;免疫标记技术; 免疫标记技术可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。 ;常用的几种免疫标记技术;免疫荧光标记技术;荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。 ;荧光效率　　荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。　　荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）　　发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。 ;荧光抗体染色方法 ： A.直接法：这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法;B.间接法：用荧光素标记二抗。检测过程分为两步：第一次，将待测一抗加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。第二，滴加标记二抗。如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记二抗就和已固定在抗原上的一抗结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。??法的优点是敏感性高于直接法，且无需制备每一种荧光素标记的特异抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。间接法的缺点是有时易产生非特异性荧光。;直接免疫荧光法原理示意图 ;放射免疫标记技术; 由于放射免疫标记技术具有灵敏度高(可检测出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物质，特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此、在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。缺点是试剂使用期限短，存在放射性污染 。目前常用的同位素是125I ;A.放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA)标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合或竞争性抑制反应。 B.免疫放射测定 (IRMA)待测抗原与过量标记抗体的非竞争综合反应。 C.放射受体分析(RRA)与免疫放射测定相似。应用放射性同位素标记配体，在一定条件下与相应受体结合成配体-受体复合物。 ;酶免疫标记技术; ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;常用的酶及其底物 ; 碱性磷酸酯 酶 (AP);辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) ; HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下: 　　　　　　　　 HRP 　 DH2＋H2O2────→D＋2H2O; 供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。; 目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为橙红色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2‘-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好，ABTS