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电泳技术 1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 3 电泳方法分类 按电场分：常压（500V，适用大分子）、高压（500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽） 一 电泳的基本原理 电泳分离： 移动方向：带电性质决定 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 μ ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 影响μ的因素： 1颗粒本身：带电、大小、形状 2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。 二 纸电泳 以滤纸为支持体的电泳技术 操作要点： 1 选择缓冲液 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响 A 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4) B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋酸，pH5.9 C 分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸pH2~3 D 分离糖类：HAC-NaAC, pH3~5 2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。 3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品） 干法、湿法 4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 5 显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 一般洗脱定量 三 薄膜电泳 支持体：薄膜 优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析 操作 1 薄膜的处理与放置 2 点样 平衡 3 电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h 4 显色 四 薄层电泳 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等 操作： 1 缓冲液选择 离子强度较高的缓冲液 2 支持物处理 精制品 3 薄层板制作 4加样：挖沟、混合样品、填埋 5 电泳 6分析：印染法 五 凝胶电泳 支持物：多孔凝胶 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因： 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳； 连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳 1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂） →聚合 催化剂： （1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED） （2）核黄素（VitB2）＋光 改变单体浓度可改变凝胶孔径 交联剂对孔径有影响：5％最小 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。 2 不连续电泳中样品压缩成层的原理 不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液： 样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液 浓缩胶：与样品胶相同 分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl缓冲液 样品压缩成层原理： 电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸 HCl→ (解离） →Cl － ， Cl －泳动速度最快（快离子） CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） → CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P压缩成层 样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P在均一的电位梯度和pH条件下分离 SDS-凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。 分离测定： 测分子量（与标准蛋白比较） 鉴定样品纯度（条带数目） 测定样品P含量：扫描定量（比色） 凝胶电泳的操作要点 1 凝胶制备 2 电极缓冲液 3 样品处理及加样 4 电泳 5 染色与固定 6 脱色 7 分析 六 等电点聚焦电泳 电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。 优点：分