教学课件-流式教程.ppt

第十二章 流式细胞技术 新疆医科大学临床医学研究院 姓名： 张雪 xx_sunnyxue@163.com 电话：4366448 ;一、流式细胞仪简介;研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选．从同一个细胞中同时测得多种参数 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量;极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 快 可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。准 定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 ;光源;细胞结构 细胞大小 细胞粒度 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量; 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： 液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。; 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150 微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。;1、液流系统;液流系统;;细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦;细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦; 样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。 台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内与激光相交（图1-1）。除BD LSR 型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。 大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外与激光相交（图1-2）。且样本压力连续可调。增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。 高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。 低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA 分析。 为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。;2、 散射光信号和荧光信号的检测;前向角散射光 ——FSC;侧向角散射光——SSC;细胞的光散射特性;上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要 信息，下图（图3-2）为FSC 和SSC 组成的二维散点图，从图中 可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。 图2-2 FSC、SSC 二维散点图 ;2.2 荧光信号;;图2-3 FITC、PE、PerCP、APC 染料的激发光谱; 如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。如FITC 和PE 双染就符合这种条件。这两种荧光素的发射光谱如图2