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人类着床前胚胎中发现大量环状RNA 近日，北京大学生物动态光学成像中心的黄岩谊，汤富酬和北京大学第三附属医院乔 杰合作完成了一项重要的circRNA研究成果：在人类着床前胚胎中系统分析不含PolyA的RNA 表达情况，其中发现了大量的circRNA。相关工作发表于Genome Biology杂志上(Dang et al., 2016)。 研究背景： 着床前胚胎中基因表达状态是深入理解胚胎发育过程非常重要的研究方向，本文作者 基于他们丰富的单细胞测序经验，针对人类着床前胚胎中PolyA— RNA进行单细胞测序分 析。 2013年，汤富酬和乔杰以及李瑞强就曾经在Nature Structural Molecular Biology 发表文章利用单细胞测序技术探索了人类着床前胚胎细胞基因表达情况，当时只是利用 Oligo d(T)进行反转录和建库，因此在这个文章中讨论的都是PolyA+的RNA表达情况。 PolyA+的RNA研究技术较成熟，但PolyA— RNA相对而言，研究的还不是非常透彻， 在细胞中如何表达并发挥功能是个神秘而有趣的问题。circRNA就是最具有代表性的 PolyA— RNA。因此在本文中，作者共分析了七个不同胚胎发育阶段的细胞，包括利用激 光显微切割分离内细胞团和滋养外胚层的细胞，利用他们曾设计和报道的SUPeR-seq技术， 最终分析鉴定到了10,032个对应于2974个基因外显子区的circRNA。有趣的是这里涉及到 的2974个基因有1554个是母系背景的基因，851个是合子表达的基因，有可能这些母系背 景的基因早在卵子发育和成熟过程中就已形成。 主要实验流程与技术： SUPeR-seq技术最早是2015年汤富酬和黄岩谊合作发表于Gonome Biology杂志的文 章中首次提出的： SUPeR-seq技术主要流程是分离单细胞，用带6nt的末端随机序列结构的引物进行第一 链的反转录，然后利用ExoSAP-IT试剂盒去掉剩余的引物，在第一链cDNA的末端增加一段 Poly A，再进行第二链合成和建库测序。利用本流程，能涵盖所有PolyA+ RNA和PolyA— RNA。 图1 SUPeR-seq流程 （来自(Fan et al., 2015)） 胚胎发育相关的circRNA如何鉴定的？ 作者利用杨力实验室开发的CIRCexplorer软件分析了测序结果中的circRNA。首先筛 选不能完全mapping至hg19的Reads，再鉴定其中同时包含同一基因的两个外显子序列的 Reads，且环化位点中间的外显子序列也能找到对应的Reads，每个候选的circRNA环化位 点至少能在同一胚胎样本中出现至少两个Reads覆盖的才算有效的circRNA。最后，作者挑 选了5个circRNA在人的ES细胞中进行了RNase R消化后QPCR验证。 胚胎发育相关的circRNA有哪些基本特征? 作者鉴定到的circRNA表达特征会随着胚胎发育的进程出现非常大幅度的动态变化过程。 平均每个circRNA拷贝数平均为92 copies/胚胎，CSPP1基因对应的circRNA种类最多，高 达46种。circRNA形成过程中经常避开第一个和最后一个外显子，在本文中发现的circRNA 同样存在这样的特征，在所有10032种circRNA中，10026种是没有第一和最有一个外显子 的，而剩下的这6个circRNA中的5个还包含了第一外显子更上游的序列，暗示着可能是进行 circRNA注释的过程中带来的非特异性的第一外显子序列。绝大部分c