7 免疫血清的制备.ppt

免疫血清的制备 一.概述： 1.免疫血清：含有某种抗体的血清。它是免疫化学和细胞免疫的主要试剂，其质量的好坏由Ab的效价、特异性决定 2.来源：由Ag免疫动物而来。 Ag可以是纯Ag（如白蛋白），也可以是复杂Ag（如人全血清） 二.免疫血清的制备： （一）动物的选择： 1.常用动物： 哺乳类较多：马、羊、猪、猴、兔、豚鼠等； 禽类： 鸡 2.选择原则： 免疫的Ag与动物的种类要求越远越好（即免疫原性好）； 与免疫血清的量有关：所需量大，用马、羊、猴等大动物；所需量小，用兔、豚鼠等小动物 动物的个体状态：雄性、适龄、健康、无感染 其它：根据实验的特殊要求 （二）抗原的条件： 具有良好的抗原决定簇（表位）：易被LC识别而产生Ab； 具有可靠的纯度； 足够大的分子量及相对复杂的空间结构； 注射量：严格掌握。宁可小，一般用25μg/kg动物；量大可出现免疫抑制 （三）佐剂的应用： 佐剂（adjuvant)：同Ag一起或预先注入机体，能增强机体对该Ag的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 多用于可溶性Ag，颗粒性Ag一般不用佐剂。 使用佐剂的目的：增加Ag的免疫原性，从而提高抗血清的效价 佐剂的种类： 1.福氏不完全佐剂（FIA）： 组成：羊毛脂＋石腊油，二者比例为4：1 FIA的制备：将Ag溶液逐滴加入羊毛脂和石腊油中，不断研磨，使Ag均匀混于佐剂中，形成“油包水”乳剂, “水包油”不行。 要形成“油包水”乳剂的原因为： 延缓Ag在体内的破坏和消失，并缓慢释放Ag； 刺激单核-巨噬细胞对抗原的处理和提呈能力。 促进淋巴细胞的增殖、分化从而增强机体的免疫应答。 2.福氏完全佐剂（FCA）： 组成：羊毛脂＋石腊油＋卡介苗 免疫效果更好，因为进一步提高、加强了免疫反应，并使免疫反应发生质的改变。 表现： 促进、诱发Ag产生强大、持久的细胞免疫反应； 促使机体合成新的Ig种类 FCA特点： 卡介苗同Ag一起加入到羊毛脂和石腊油中，几滴即可； 免疫效果较好； 注射局部易形成肉芽肿，溃烂，但对Ab生成无危害。 3.另外还有明矾佐剂、氢氧化铝佐剂等非免疫原性佐剂 4.细胞因子佐剂：与Ag合用可以有效地激发机体免疫功能，增强免疫反应。如IL-2、IFN-γ、IL-1等 （四）免疫程序及采血： 1.注射途径：常用的有：静脉、皮内、皮下、淋巴结、腹腔 采用一种途径多点注射 可溶性Ag：常选用皮内或皮下（皮内易引起细胞免疫反应，对产生Ab更有利） 颗粒性Ag：常选用静脉或腹腔 若Ag量少，可直接注射淋巴结 2.注射间隔及次数: 单次注射：Ab生成慢、持续时间短、效价低，但特异性好； 再次注射：注射两次，Ab效价上升快，持续时间长； 间隔一定时间多次注射：Ab效价高、生成时间长，但特异性差。间隔时间一般为7-15天 一般采用后两种注射方法 3.注射量： 蛋白质Ag一般注射1-4mg/次，注射量过大易形成免疫耐受 4.免疫程序的制定 5.试血和放血： 试血：末次Ag注射后，测定血清中Ab的效价，叫试血。若Ab达到所需效价，即可放血。若未达到，继续追加免疫Ag一次。 试血：可溶性Ag：用双扩（梅花孔型）；颗粒性Ag：用直接凝集试验（试管法） 放血：直接颈动脉放血或直接心脏穿刺抽血。然后分离出血清，即可得到Ab Ab效价判定 以出现明显凝集现象的（记为：++ 凝集）的抗体最高稀释度为该抗体的效价（又称 滴度Titer) 6.鉴定 Ab效价的鉴定： 可溶性Ag用双扩法（梅花孔型）； 颗粒性Ag用直接凝集试验（试管法） Ab特异性的鉴定：双扩法（双孔型） 方法：在琼脂上打两排孔，左边一侧一孔加粗Ag（Ag粗提物），一孔加纯Ag（特异性Ag），右边一侧两孔分别加抗血清，放37oC、24h。 结果：若抗血清与 粗Ag和纯Ag之间皆出现一条沉淀线，且两条线融合，则说明动物已产生单价特异性Ab；若与纯Ag出现一条线，与粗Ag出现多条线，则说明有杂Ab。 Ab纯度的鉴定： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，若出现多条电泳带，即提示抗血清中杂蛋白较多，需进一步纯化 7.保存： 小包装低温保存：-20oC,避免反复冻融，可保存5年，效价不下降； 冰冻干燥保存：用冰冻干燥器使免疫血清形成冻干粉，可保存5-10年； 4oC加防腐剂保存：可保存半年。如石炭酸、叠氮兰、硫柳汞等防腐剂 思考题: 1.免疫血清制备的主要程序。 2.佐剂概念、作用机理、福氏不完全/完全佐剂的组成。 * * 测抗体效价：双扩梅花孔型 试 管 凝