载体构建流程详解.ppt
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经典载体构建流程;I 载体构建流程 ;提取mRNA;RT;PCR得到目的基因 ;PCR常出现的问题 ;解决方法;PCR产物纯化 ; 酶切目的基因和载体 ;酶切注意事项;酶切常见问题;纯化酶切产物 ;; 连接 ;;转化;菌落PCR ;酶切检测阳性克隆;挑取阳性克隆去测序;
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I载体构建流程cDNA提取mRNA得到目的基因RTPCRPCR产物纯化酶切目的基因和载体纯化酶切产物连接转化菌落PCR挑取阳性克隆去测序测序正确的摇菌提质粒保菌导入表达宿主测试表达情况提取mRNA如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵180℃，4h。RT由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来的断
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I载体构建流程cDNA提取mRNA得到目的基因RTPCRPCR产物纯化酶切目的基因和载体纯化酶切产物连接转化菌落PCR挑取阳性克隆去测序测序正确的摇菌提质粒保菌导入表达宿主测试表达情况第2页,共23页，2024年2月25日，星期天第3页,共23页，2024年2月25日，星期天提取mRNA如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品采用连续灭菌两
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演讲人：;目录;01;明确构建目标与需求;如腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等，具有高感染效率和基因表达能力。;准备所需材料与试剂;;02;;;识别并切割DNA分子中的特定序列，产生黏性末端或平末端。;纯化方法;03;;;在载体中插入目的基因或调控元件，实现目的基因的表达或调控。;;04;连接反应是载体构建中的关键步骤，指将两个DNA片段通
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关于载体构建流程第1页，共23页，星期日，2025年，2月5日I载体构建流程cDNA提取mRNA得到目的基因RTPCRPCR产物纯化酶切目的基因和载体纯化酶切产物连接转化菌落PCR挑取阳性克隆去测序测序正确的摇菌提质粒保菌导入表达宿主测试表达情况第2页，共23页，星期日，2025年，2月5日第3页，共23页，星期日，2025年，2月5日提取mRNA如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。操作过程所用器
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2025年基因表达载体构建中限制酶挑选策略详解.doc
限制酶选择的三大根据
1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
图1
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选择PstⅠ(目的基因两端均具PstⅠ)。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因,如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)為防止目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不一样的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要保证质粒上也有这两种酶的切点),并且这种切点不至于完全破坏“标识基因”。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以保证具有相似的
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克隆载体与表达载体详解.doc
克隆载体
基本性质 基本特征（或载体的构建） 原理机制 常用的载体 克隆载体 质粒载体 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒） （1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗菌素选择原理） pSC101
ColE1
pBR322
pUC18
pUC19
TA载体 噬菌体载体 λ噬菌体
其DNA两端的
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Gateway载体构建系统.ppt
Gateway载体构建系统 主要内容 什么是Gateway技术 Gateway克隆原理 Gateway技术的特点 Gateway技术的改进与发展 为什么要构建Gateway载体系统？ 传统的酶切连接方法的缺陷 1、需要繁琐的酶切连接，工作量大，难 以满足大规模克隆的需要。 2、往往难以找到合适的酶切位点而面临诸多的技术困难，影响实验的效率。 Gateway克隆（通路克隆） Gateway克隆技术是一个高效的大规模克隆系统，由Invitrogen公司开发。该技术利用λ噬菌体的位点特异性重组(λ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互相转换)，
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如何构建载体.doc
如何构建载体1 启动子的选用和改造
? 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
? 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植
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质粒载体的构建.doc
质粒载体的构建
摘 要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。
关键词： 质粒 DNA PCR 电泳 感受态 转化
引言
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：
是染色质外的双链共价闭合环形DNA（
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Gateway载体构建.ppt
Gateway技术 克隆、表达新方法 Gateway技术 Gateway技术： 一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。 Gateway技术特点： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。 Gateway技术的灵活性： Gateway技术的原理 Gateway的原理也是
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基因表达载体的构建.pptx
第六章??????外源基因在大肠杆菌中旳体现调控;第一节???????基因体现旳概述和基本条件
;第二节???????在大肠杆菌中影响外源基因体现旳因素;一、基因体现旳基本概念;二、基因体现旳基本条件;三、真核基因在原核细胞中体现及调控;㈠有效转录及其调控元件;㈡对的转译;㈢原核体现载体旳构建;启动子;启动子构造对体现效率旳影响;体现载体旳选择;外源基因（cDNA）中密码子旳作用;mRNA旳一级构造与基因体现;mRNA旳二级构造对翻译起始旳影响;mRNA稳定性旳影响;真核基因在原核细胞中体现及调控旳特点;RNA聚合酶;启动子旳概念;转录作用旳终结;转录旳弱化作用;起始密码子;核糖体结合位点;体
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打靶载体构建.doc
利用同源重组技术进行打靶载体的构建
孔 冬
小鼠遗传学实验室
南京大学模式动物研究所
基本原理
传统意义上的打靶载体的构建受基因组DNA上限制性内切酶位点的强烈局限。考虑到后期利用Southern杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶是否可以区分重组和野生型染色体，同时顾及同源臂两端的内切酶是否能与常用载体的多克隆位点相匹配，最后可供我们进行选择的打靶区域往往非常有限。而近年来发展起来的基于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统为我们摆脱这种束缚提供了一个有效的平台。高效、省时、灵活是该系统的三大特点。2004年底小鼠129品系BAC文库末端测序的完成更为这一技术的应用提供了巨大的便利。
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质粒载体的概况及构建.ppt
**************质粒载体的概况及制备质粒的定义、命名1质粒的基本特性2质粒的分类3质粒载体的概况（一）质粒的定义、命名★质粒不是细菌生长所必须的★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力★分子量在1~200kb之间定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。质粒的定义、命名：命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后面接实验编号。质粒（plasmid）特点：能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。（二）质粒的基本特性（2）不相容性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）控制质粒拷贝数的基因能独
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基因表达载体的构建.ppt
二、基因表达载体的构建（核心步骤）先用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将二者连接，形成重组DNA分子。常用的受体细胞：01有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。02三、将目的基因导入受体细胞（转化）01农杆菌转化法：主要侵染双子叶植物（伤口分泌酚类化合物吸引农杆菌）基因枪法花粉管通道法02031、受体细胞是植物细胞1）土壤农杆菌法2）基因枪法3）花粉管通道法2、受体细胞是动物细胞显微注射法注入动物受精卵1982年，世界上第一例体型比普通小鼠大1.8倍的转基因超级小鼠诞生一般用CaCl2处理，改变细胞膜的通透性，使得重组DNA能够进入细胞。04要想使重组DNA顺利进入细
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DNA重组载体构建.ppt
PCR模板 ●已有带有目的基因的质粒。 ●细胞或组织Total RNA 反转录的cDNA。 DNA polymerase PCR的条件： 94℃ 5min 94℃ 30s 55℃ 30s 30 cycle 72℃ 30s 限制性内切酶 酶切PCR产物和质粒载体 单酶切（顺序酶切） 双酶切（*共用Buffer，酶活） 纯化酶切产物 切胶回收