人类淋巴细胞株培养.doc

本科学生综合性实验报告 学号 姓名 学院 生命科学学院 专业、班级 实验课程名称 细胞生物学实验 教师及职称 倪娟（助理实验师 （3）熟练掌握细胞传代培养的操作方法。 （4）观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 （5）掌握死活细胞的鉴别原理及方法。 2.实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理： （1）传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作 （3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。 （4）细胞培养使用的培养基一般是由 （5）氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。 （6）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。但由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。 （7）细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。由于许多酸性物质不易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色以来区别死活细胞。 实验流程： 一、细胞培养准备工作： （1）洗液的配置：重铬酸钾6.3g加蒸馏水20ml加热充分溶解后冷却再加入浓硫酸100ml充分溶解再倒入洗液缸 （2）玻璃器皿清洗 干燥 酸性洗液浸泡过夜 清洗 干燥 包装 消毒灭菌 备用 （3）胶塞清洗 干燥 包装 消毒 灭菌 备用 二、培养基的配制： 配置RPMI1640培养液 加酚红通入CO2 超净台中过滤除菌 按一定比例加小牛血清、谷氨酰胺和双抗溶液 三、细胞传代培养： 超净工作台中取8ml生长培养基到自己的细胞培养瓶中 接种适量细胞悬液 旋上盖子 放入二氧化碳培养箱中平放并旋松瓶盖 四、死活细胞的鉴别： 倒置显微镜下观察 将细胞团吹散 取一定量的细胞悬液到离心管中 加入等体积台盼蓝染液混合并放置1min 用血球计数板在显微镜下进行死活细胞的计数 计算每毫升原液细胞数以及细胞存活率 3.实验设备及材料 （一）仪器： 超净工作台、干燥箱、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、显微镜、血球计数板 微孔滤膜（直径25mm，孔径为0.22um）、细胞培养瓶、玻璃棒、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸 、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、各种规格的Tip 、离心管 、细胞培养瓶、滴管、人类淋巴细胞株 （三）试剂： 75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、1%酚红 、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素 、饱和NaHCO3 、L-谷氨酰胺 、三蒸水、乙醇、0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制） 4.实验方法步骤及注意事项 实验步骤： 一、准备工作： （一）清洗： 1.新玻璃器皿的清洗： 先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。 2.使用过的玻璃器皿的清洗： （1）立即进入清水，避免干涸难洗； （2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥； （3）浸酸性洗液过夜； （4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒