3 第三讲2 常用分子克隆工具酶简介.ppt
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常用工具酶简介 ;第一节
DNA连接酶(DNA ligase) ;;;2 DNA ligase简介
2.1 T4 DNA ligase
连接类型:
DNA-DNA
DNA-RNA
RNA-RNA
dsDNA的黏性末端和平末端
;2.2 大肠杆菌 DNA ligase
dsDNA的黏性末端和平末端
;;;;;;1 DNA polymerase分类;1.1 Ecoli DNA polymerase I
分类:
DNA pol I
DNA pol Ⅱ
DNA pol Ⅲ;; Mn2+存在时 ;1.2 Klenow片段
大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌蛋白酶水解产物。
活性:5’ ? 3’聚合酶
3’ ? 5’外切酶;用途:
⑴ 3’-末端补平
⑵ 3’-末端抹平
⑶ cDNA第二链合成
⑷ 双脱氧系统测序;3’-末端补齐 3’-末端标记
5’-ACGTTGCAAACTG-3’
3’-TGCAACGTTTGAC…..5’
cDNA第二链合成
mRNA 3’-UGCAACGUUUGAC…..5’
c DNA 5’-ACGTTGCAAACTG
GAC
;5’; 1.3 T4 DNA polymerase
特点:
5’→3’聚合酶活性
3’→5’外切酶活性
;;1.4 Taq DNA polymerase
特点:
分离自水生栖热菌,分子量为94,000,最适反应温度75-80℃ 。
5’-3’聚合酶活性
5‘-3’外切酶活性
用途:
主要用于DNA的体外扩增
;Taq Pol 和PCR ;1.5 反转录酶(reverse transcripase)
用途:
⑴ cDNA第一链的合成
⑵补平反应
⑶用于DNA测序
;;1.1 末端转移酶(TdT)
⑴ 反应特点
在酶的催化下将dNTP加到DNA分子的3‘OH末端,催化作用不需要模板。
⑵ 用途
3’-加尾,便于两DNA分子重组
3’-末端标记 ; [γ-32P]ATP ATP ;1.2 T4 多聚核苷酸激酶
用途:
1) DNA或RNA的5’末端标记
2) 分子克隆过程中以获得5’-磷酸基末端,便于连接酶反应;1.3 碱性磷酸酶
用途
1) 载体DNA的去磷酸化,防止自我连接,以增加重组频率
2) 5’端 核酸末端标记
; I II ;;;;1.1 S1核酸酶
特点: ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区
用途
1) 基因突变--缺失,常与外切酶,如ExoIII、λ外切酶、Bal31连用
2) DNA定序分析
3) S1作图法
4) 基因结构分析
5) tRNA结构分析
;;;1.3 DNase I
用途
1) 切口移位,制备DNA探针
2) 制备RNA样品时除去DNA分子
3) 基因突变时产生切口 ;ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口; Mn++存在时 ;;1.1 RNase ;1.2 RNase H; 5’—AAGCTT—3’ HindIII 5’—A AGCTT—3’
3’—TTCGAA—5’ 3’—TTCGA A—5’
S1
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