westernblot失败经验总结..doc
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western?blot失败经验总结1
我做了很久的WB,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做WB的话,感觉以“快速彻底裂解,先变性后保存”的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给loading buffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loading buffer100度充分变性,再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于WB的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ECL法下限是0.1ng,即100pg),最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量,千万别把样品搞稀了,否则就不好办了。最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何选等等。
western?blot失败经验总结2
我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意,不能混浊,有时候能用个3-4次,有时候第二次都不行了,事先前预电泳一下,看看气泡的均匀度;Buffer一定要淹过梳子孔,否则就会发现今天的蛋白不会跑;跑的时候先用低电压跑过浓缩胶,再换高电压跑分离胶,不要追求速度,慢慢跑条带会分离的更好,特别是对于高分子量的目的蛋白;2、转膜 我用的是湿转,Buffer一定要预冷,最好提前一天配好放4度;滤纸不要大过PVDF膜,防止短路;胶在负极,膜靠近正极,放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首;膜要标记好正反面;转膜过程中,经常过去看看,防止意外,如电泳仪接触不好。
WESTERN?BLOTTING心得
1.??总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核): 组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存2.组织膜蛋白提取:所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.(2)离心机 1000rpm,4℃ 离心 10min 后,所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)(3)100000g,4℃ 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心,取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B重悬,4度过夜后,分装至 EP管,Eppendorf 台式离心机 10000rpm,4℃ 离心 30min。(4)收集所得上清液即为膜组份。Buffer A: 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl(PH 7.5),120mM KCl,1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B 20mM HEPES(PH 7.5),10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM,PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存。如果要定量的话,最好能立即根据浓度,加入上样缓冲,煮沸,4度保存。反复冻融蛋白会降解,浓度不准。考马斯亮兰G250测蛋白浓度:考马斯亮兰G250配方:G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。BSA标准液:0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。配制标准液(浓度分别为0,10,20,30,40,50ug/ul):??1??2??3??4??53??6G250??3ml??3ml??3ml??3ml??3ml??3ml0.5mg/ml BSA????20ul??40ul??60ul??80ul??100ulddH2O??100ul??80ul??60ul??40ul??20ul??待测蛋白配液:每管3ml G250,2ul样品,98ul ddH2O。(若加入样品后,液体没有变蓝色,则可再加2ul样品,ddH2O减为96 ul,标准液浓
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