第3章核酸的分离与分析基因工程原理与技术刘志国课件.ppt

第三章 核酸的分离与分析 第一节 核酸的分离纯化 一、核酸分离提取的原则与要求 二、核酸提取的主要步骤 三、质粒DNA的分离纯化 四、基因组DNA的制备 五、RNA的提取 六、核酸的定量 一、核酸分离提取的原则要求 总的原则： 保证核酸一级结构的完整性， 防止降解，排除其它分子的污染。 如：防止核酸酶，特别是RNase的污染， 又如：提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。 二、核酸提取的主要步骤 1. 样品准备 2. 细胞破碎 3. 分离纯化核酸 4.核酸的沉淀浓缩 1. 样品准备 新鲜动植物组织材料：清洗、去掉杂质。少量样品可用液氮冻结，然后快速碾磨成粉未状。 动物细胞：胰酶消化，离心沉淀，PBS液漂洗，收集沉淀的细胞。 液体培养的微生物：直接离心沉淀收集菌体。 2. 细胞破碎——物理方法、化学方法、酶法等。 物理方法：超声波法、匀浆法、液氮破碎法等。 （注意：物理方法容易导致DNA链的断裂） 化学方法和酶法：去污剂（SDS 0.5%~1.25%）和溶菌酶或蛋白酶K温和裂解。 EDTA（5mmol/L)作用：与Mg2+结合，抑制核酸水解酶.除去RNA，可加入适量RNA酶。 3. 分离纯化核酸 关键步骤是去除蛋白质，还要避免核酸的降解。 酚/氯仿抽提法： 酚、氯仿: 两种不同的蛋白质变性剂。氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 异戊醇: 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 4.核酸的沉淀浓缩 乙醇沉淀法：无水乙醇结合核酸分子所结合的水，使核酸沉淀。 微量的DNA，可加入中等浓度的单价阳离子促进沉淀。如Na+，中和DNA分子上的负电荷，减少了DNA分子间的同性电荷相斥力。 三、质粒DNA的分离纯化 重点考虑如何与基因组DNA相互分开。 ——利用质粒分子量小和闭合环状超螺旋结构性质。 分离方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解法、CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法等。 1. 碱裂解法： 小量制备DNA较好的方法。 基本原理：在碱性pH（12-12.5）下，DNA分子均变性，恢复中性时，线性染色体DNA由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕，不能准确复性而沉淀；质粒DNA分子因紧密缠绕在一起，能准确复性而留于上清溶液中。 2.煮沸法 利用DNA加热变性原理，结合不同DNA复性的差异进行分离。复性的超螺旋质粒DNA分子以溶解状态存在液相中，通过高速离心（12,000?×?g）可实现分离。 适于快速提取质粒?DNA并进行鉴定，也适用于大量提取，对纯度要求高的，可做进一步纯化处理。 3. CsCl-EB密度梯度平衡离心 CsCl是一种大分子量的重金属盐，长时间超速离心时，在管中形成1～1.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。染色体DNA、质粒DNA、RNA以及蛋白质等，可在离心管内不同位置形成区带。RNA可与Cs+结合，因此密度最大，沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。 四、基因组DNA的制备 基因组DNA分子量大，受热易变性，复性困难，受剪切力作用易断裂，因此要采用较温和的条件和方法。如SDS加上蛋白酶K温和裂解方法。 杂蛋白质的去除可用酚/氯仿萃取法。对植物基因组可能需要注意的是糖类的除去，可选用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）选择性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化铵（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。 五、RNA的提取 细胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分开，可先制得细胞核、线粒体、核糖体等细胞器和细胞质，然后再从中分离某一类RNA。 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，分离较为困难。可利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT)亲和色谱柱分离。 RNA的提取要点： ①样品细胞或组织的有效破碎； ②核蛋白复合体变性解离，释放出RNA； ③对RNA酶的有效抑制； ④将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离； ⑤多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。 最关键的是抑制RNA酶的活性。 六、核酸的定量 核酸定性定量分析是指导核酸分离纯化的重要手段。 常见的方法：紫外分光光度法、荧光分光光度法。 紫外分光光度法 核酸的最大吸收波长是260nm，吸收波谷在230nm。 根据测定，在波长260nm时，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg／mL；单链