第三章细胞生物学方法课稿.ppt

第三章细胞生物学研究方法 目录 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 第五节 模式生物与功能基因组的研究 第一节 细胞形态结构的观察方法 光学显微镜 包括：普通复式光学显微镜、相差和微分干涉显微镜、荧光显微镜、激光扫描共焦显微镜。 电子显微镜 包括：透射电子显微、扫描电子显微镜。 光学显微镜 1．普通光学显微镜 (1) 结构： ①照明系统(光源,聚光镜) ②光学放大系统(主体) （物镜、目镜） ③镜架及样品调节系统 (镜筒、物镜转盘、调焦旋钮、载物台、镜臂、底座） 1、基本结构 A:电子束照明系统（主体） B:成像系统 C:真空系统 D:记录系统 JEM-1011透射电子显微镜 电子显微镜的基本构造 电子显微镜的主要电镜制样技术 1.超薄切片技术P36图 固定 -- 脱水 -- 包埋 -- 切片 -- 染色 固定：常用固定剂锇酸或戊二醛，能迅速渗透组织，目的保持样品形态结构的真实性。常在低温下进行，防止酶的自溶作用造成的破坏。 脱水：常用脱水剂酒精或丙酮。样品经固定后通常含有大量水分，而包埋剂是水不相溶的，包埋前需要经系列梯度脱水。 包埋：常用包埋剂环氧树脂，作用赋予样品以刚性和柔性，便于切片完整。 切片：用超薄切片机，玻璃刀片（常用）或钻石刀片，切片收集与载网上。 染色：用重金属盐染色，以增大反差。 超薄切片样本制备示意图 三种不同光镜拍摄的体外培养成纤维细胞图像比较 A.普通光学显微镜 B.相差显微镜 C.微分干涉显微镜 第二节 细胞及其组分的分析方法 原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意和甘酸序列在染色体或在细胞中的位置的方法。 流式细胞分选技术：利用细胞中的DNA、RNA或某一特意标记蛋白的含量不同进行分选。 第三节 细胞培养与细胞工程 细胞培养 动物细胞培养 1 原代培养： 细胞系：存活的细胞可顺利的传40至50代次，并且仍保持原来染色体二倍体的数量，及接触抑制的行为 细胞株：具有特殊的遗传标志或性质的细胞系 2 传代培养 体外培养的细胞，一般不能保持体内原有的细胞形态，但大体可分为两种基本形态：成纤维样细胞，上皮样细胞 植物细胞培养： 1 单倍体培养： 用花药在人工培养基上进行培养，从小孢子直接发育成胚状体，然后长成植株 2 原生质体培养： 用植物的体细胞（二倍体细胞）经处理去壁后在无菌培养基中生长分裂诱导分化，长成植株 细胞工程 细胞融合： 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象 单克隆抗体技术： 是指将缺陷型小鼠骨髓瘤细胞与免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）融合，HAT选择培养 显微操作技术： 通过显微操作装置进行细胞核移植基因注射的 单克隆抗体技术 1、制备小鼠免疫细胞和培养骨髓瘤细胞 2、PEG诱导融合 3、HAT培养基筛选杂交瘤细胞 4、阳性克隆的筛选和克隆化 5、克隆扩增及大量制备McAb 第四节 细胞及生物大分子的动态变化 荧光漂白恢复 单分子技术与细胞生命活动的研究 酵母双杂交技术 荧光共振能量转移技术 放射自显影技术 第五节 模式生物与功能基因组的研究 模式生物的特点： 个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快 常用模式生物： 大肠杆菌，酵母，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠，拟南芥等