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检测波长选择实例没食子酸紫外吸收图谱 检测波长通常选择其最大吸收波长 测定波长 参比波长2：Off 参比波长1：300nm 响应值1 响应值2 由于很多成分在低波长均具有紫外吸收，故为避免干扰，通常不宜选低波长做测定波长 含量测定方法学考察 4. 线性实验 绘制标准曲线，确定线性范围(回收率中高浓度组不能超过这个范围) 5. 精密度实验 取同一样品或对照品，连续测定五次，峰面积RSD％不得大于3％。 6. 重复性实验 取同一批号样品，按样品测定方法操作，测定五份，样品含量RSD％不得大于3％ （由于每份样品取样量不同，故应计算含量的RSD） 。 7. 稳定性实验 取同一样品， 分别于制备后0、2、4、8、12、24、36h测定，峰面积RSD％不得大于3％。（通常考察36h内的稳定性） 8. 回收率实验 取同一样品， 分别添加高、中、低三组浓度对照品（每组三份），测定峰面积，并计算回收率，回收率应在95～105％间，RSD不大于5％。操作复杂的特殊样品要求在90～110％ 。 高、中、低三组浓度与样品含量之比约为：1.2、1、0.8 含量测定 外标法 按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量： 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量或或自动进样器进样为好。 外标一点发为最常用的定量计算方法。 式中: C 为浓度，A为峰面积； X为供试品，R为对照品。 内标法 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子： 式中: C 为浓度，A为峰面积； S为内标物，R为对照品。 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量： 式中: C 为浓度，A为峰面积； S为内标物，X为供试品。 加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作较正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。 测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10％～25％或其峰面积能准确积分［通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%~2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%］。然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。 不加校正因子的主成分自身对照法 当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。 若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。 面积归一化法 由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。 常用于考察对照品含量是否达到98％。 HPLC含量测定应用实例 黄金咽喉片中绿原酸的含量测定 黄金咽喉片是由黄花蒿、金银花、青果、乌梅、甘草和薄荷等多味中药提取的有效部位及有效成分组成的复方制剂。实验采用HPLC测定金银花所含的主要有效成分绿原酸 。 色谱条件 色谱柱：Dikma Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相：甲醇–0.4％磷酸溶液（26∶74）； 检测波长：326 nm； 柱温