总蛋白的六种检测方法.pdf

好苦逼 总蛋白的六种检测方法 （一）凯氏定氮法 将血清与强酸一起加热消化， 使血清中的含氮化合物转化为铵盐， 再加碱使铵盐成为氨 进经蒸馏分离出来，最后用酸滴定测定氮量，按每克氨相当于 6.25g 蛋白质计算蛋白质的浓 度。 应用历史较久，结果较准确，是蛋白质测定的参考方法，但操作复杂，影响因素较多，且不 少蛋白质的含氮量并非 16% ，不适用于日常工作，目前多用于标准蛋白的标定及校正其它 的常规方法。 （二）双缩脲法 蛋白质中的肽键 （-CONH- ）在碱性条件下与 Cu2+络合成紫红色复合物， 产生的颜色强度在 一定范围内与蛋白质含量成正比。 此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲（ H2N-CO-NH-CO-NH2 ）与碱性铜溶液作用形成 紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。几分子中含有两个甲酰胺基 (-CO-NH2) 的化合物都 能出现此反应。 因至少含 2 个 -CONH- 基团才能与 Cu2+ 络合， 所以氨基酸和二肽无此反应。 体液中小分子肽 含量极低， 故血浆中除蛋白质外几乎不存在可与双缩脲试剂显色的物质， 且各种蛋白质显色 程度基本相同。 此法简便、准确、重复性好，在 10-120g ／L 。浓度范围内呈良好的线性关系，批内 CV 值 2％，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。 （三）酚试剂法 蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸 -磷钼酸反应生成蓝色化 合物。 Lowry 改良法在酚试剂中加入 Cu2+ ，提高了呈色的灵敏度，其中 75％呈色靠铜离子 产生。 Lowry 改良法的灵敏度为双缩脲法的 100 倍左右。 由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的比例不同，如白蛋白含色氨酸为 0.2 ％，而在一些球蛋 白中色氨酸含量高达 2 ％~3 ％，因此使用本法测定纯粹的、单一的蛋白质较合适。此法灵敏 度较高，为 10~60ug ／ml ，因而适用于测定蛋白质含量较少的标本 (如脑脊液 ) ，但试剂反应 易受还原性化合物糖类、酚类及多种药物如水杨酸、氯丙嗪和某些磺胺药的干扰。 （四）紫外分光光度法 蛋白质分子内的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在 280nm 波长处有一吸收 峰，依此性质可用于蛋白质定量。 由于各种蛋白质中芳香族氨基酸的含量和比例不同， 血清中游离的酪氨酸和色氨酸在 280nm 处也有吸收，因尿酸和胆红素在 280nm 处也有干扰，因而本法的准确性和特异性都受到很 大的影响。 此法敏感而且简便， 由于制剂未经任何处理， 蛋白质的生物活性得以保留， 故常用于较纯的 酶和免疫球蛋白的测定。但此法需紫外分光光度计和石英比色杯。 （五）染料结合法 在酸性环境中，蛋白质分子解离出的 -NH3+ ，可与染料的阴离子产生颜色反应。常用的染料 有氨基黑、考马斯亮蓝等。这一性质可用于电泳后蛋白质的染色和血清总蛋白测定。 此法操作简便、重复性好、灵敏度高、且干扰因素较少。缺点是特异性不高，分子量 3 000 以上的多肽也参与反应。 另外， 不同蛋白质和染料的结合力不一致， 因此很难找到一种合适 的物质作标准物，使此方法的应用受到限制。 （六）比浊法 用某些酸类 (如二氯醋酸、 磺基水杨酸等 ) 和血清蛋白质结合产生沉淀，