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97组织纤维溶酶原激活物t.pdf

发布:2018-06-03约3.81千字共5页下载文档
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【名称】组织纤维溶酶原激活物 【英文名】tissue plasminogen activator activity 【别名】t-PA 【概述】 组织纤溶酶原激活物是一种单链糖蛋白,主要由血管内皮细胞合成、分 泌,不断释放入血液,广泛存在于机体的各种组织内,肝脏是组织纤溶酶原激 活物灭活的主要场所。它对纤维蛋白有高度亲和力,然后将酪氨酸纤溶酶原形 成纤溶酶。降解纤维蛋白(原)和部分凝血因子。是纤溶系统的关键物质。 【原理】 (1)活性测定 (t-PA∶A,发色底物法之 ):血浆优球蛋白部分含有包括 t- PA以及全部凝血因子,但不含 PA抑制物。加入过量的纤溶酶原与纤维蛋白的 共价物,样品中之 t-PA易吸附于纤维蛋白,并将血纤溶酶原转变成纤溶酶,后 者使发色底物显色。血浆 t-PA与显色的深浅呈正相关。 (2)活性测定 (t-PA∶A发色底物法之二):在 t-PA和加速剂作用下,纤溶 酶原转变为纤溶酶,后者使发色底物 S-2390释放出发色基团 PNA。PNA显色的 深浅与纤溶酶和 t-PA呈正比关系。 (3)抗原测定 (t-PA∶Ag)ELISA法:本试验根据双抗体夹心法原理,即将纯 化的 t-PA单克隆抗体包被在固相载体上温育,然后加含有抗原的待测标本。标 本中的 t-PA抗原与固相载体上的抗体形成复合物。此复合物与过氧化物酶标记 的t-PA单克隆抗体起抗原抗体结合反应,形成 t-PA-POD复合物。后者可使邻 苯二胺基质液呈棕色反应,其反应颜色深浅与标本中 t-PA含量呈正比关系。 【试剂】 (1)活性测定 (t-PA∶A,发色底物法之 ): ①50mmol/L磷酸盐缓冲液。 ②纤维蛋白-纤溶酶原共价物:375mg/L的纤维蛋白,250μ/L的纤溶酶 原。 ③发色底物:3mol/L S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-PNA)。 ④组织纤溶酶原激活剂。 ⑤0.25%醋酸。 5.6IU/ml,S 2.8IU/ml)。 ⑥t-PA标准 1 和2(S  (2)活性测定 (t-PA∶A发色底物法之二): 上海医科大学试剂盒。 ①标准品 t-PA(80IU)。 ②去t-PA人血浆。 ③人纤溶酶原。 ④发色底物 S-2390。 ⑤浓缓冲液 TB。 ⑥加速剂。 ⑦浓抗凝液。 ⑧浓酸化液。 ⑨其他:蒸馏水、50%冰醋酸。 (3)抗原测定 (t-PA∶Ag)ELISA法: ①抗体:抗t-PAF(2b') 。  ②过氧化物酶抗体复合物抗:t-PA-peroxidase。 ③基质:邻苯二胺。 ④基质缓冲液:0.2mol/L柠檬酸,0.2mol/L 柠檬酸钠缓冲液。 ⑤稀释缓冲液:白蛋白-磷酸盐缓冲液 (PBS-BSA)。 ⑥洗涤液:0.025mol/L 氯化钙-Tween-20-PBS缓冲液。 ⑦t-PA标准:组织纤溶酶原缴活物。 ⑧0.11mol/L 柠檬酸钠溶液。 ⑨30% H O 。   ⑩终止液:3mol/L硫酸或 1mol/L盐酸。 【操作方法】 (1)活性测定 (t-PA∶A,发色底物法之 ): ①血浆处理:按表 1 进行操作。 ②操作方法:按表 2 进行 。 (2)活性测定 (t-PA∶A发色底物法之二): ①血浆制备:静脉采血,置于含 1/10体积抗凝液的硅化试管中,尽快低温 分离血浆。取血浆 200μl,加酸化液 200μl,混匀,置-30℃保存。测定时酸 化血浆作 1∶60 稀释。 ②取去 t-PA血浆和 t-PA标准品配制标准 t-PA系列 (表 3)。
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