相对荧光定量PCR三种常用方法注意事项..doc

相对定量方法实际操作 （三种常用方法） 本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。 Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例： 如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法两进行相对定量。 在完成上述预实验之后，接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。 在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增，下图即为一个标准的扩增分析结果： 为进行Comparative Delta-delta Ct分析，需要对样品进行一些编辑。简而言之，即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。 在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家基因，10-18号管检测了目的基因。 可通过NEW新建一个page，并通过Selected选择每页中分析的对像。将两组基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下图所示： 样品编辑好后就可进行分析工作。通过进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。注意：由于没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖动光标即可。 完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT分析界面，选择show，此时，软件的向导界面会提示使用者一步步完成设置： 由上至下，依次完成各项设置。 第一项：Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。选择Yes； 第二项：Gene of Interest Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的基因的那一页； 第三项：Normaliser Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的那一页； 第四项：Calibrator Defined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照组的一个。 完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示： 结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT值，以及样品B、C中目的基因的浓度相对于对照组A的比值。 双标准曲线法定量流程（RG6000软件设置） 用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准曲线，必需有一组稳定的标准品。 同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页上。 公式： （基因的浓度由软件根据标准曲线直接给出） 双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用 双标准曲线法做相对定量分析的最大特