银杏叶提取物对胶质瘤细胞NFκB表达与NO生成的调控.doc

银杏叶提取物对胶质瘤细胞NFκB表达和NO生成的调控 【摘要】 目的 研究 银杏叶提取物（EGb761）对C6胶质瘤细胞核转录因子κB（NFκB）表达和可诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）生成的 影响 。 方法 以脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）诱导体外培养的C6胶质瘤细胞表达可诱导型一氧化氮合酶、产生大量NO， 应用 激光共聚焦成像系统和NO荧光探针监测细胞内NO浓度变化，逆转录基因扩增技术和蛋白质印迹技术检测EGb761对C6胶质瘤细胞中iNOS基因表达的影响，并探讨这一调控作用的分子机制。结果 EGb761能明显降低C6胶质瘤细胞中iNOS mRNA和蛋白的表达、减少NO的生成，抑制IκBα的降解和阻止p65/RelA进入细胞核。结论 EGb761可通过NFκB信号通路对C6胶质瘤细胞iNOS基因表达和NO的生成进行调控。 【关键词】 银杏叶提取物；胶质瘤细胞；可诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；核转录因子κB Regulatory Effect of Ginkgo Biboba Extract on the Expression of NFκB and Nitroxide Production in Glioma Cells Key words：EGb761; Glioma cell； iNOS; Nitric oxide; NFκB 银杏为最古老的中生代孑遗稀有植物之一，属裸子植物门银杏纲银杏科植物，现仅存一科一属一种，有裸子植物“活化石”之称。银杏树的根、叶、皮及种子均可药用。银杏叶入药始于明代，传统医学用银杏叶 治疗 哮喘、支气管炎和老年性心血管疾病，但叶中含有氢氰酸，可加速心率，副作用大。20世纪60年代后，德、法等欧洲国家先后开展了对银杏叶的研究。1965年，德国威玛舒培博士(Dr. Willmar Schwabe)药厂正式上市全球第一个银杏叶标准提取物EGb761（ginkgo biloba extract），其质量指标为黄酮苷≥24%，萜内酯≥6%，银杏酸≤10ppm，此标准为许多国家所公用。但国际上并没有制定正式统一的标准，也没有统一的含量测定方法，各厂商都有自己的质控指标，且不同的地区、不同的季节、不同的加工方法和不同的制剂工艺对银杏叶中药效成分影响很大。 资料表明银杏叶含有多种药用活性成分，其有效成分主要是银杏内酯和黄酮类(以槲皮素、山奈素、水杨梅素为主)[1]。近年来，生物类黄酮抗氧化活性倍受人们的重视，生物类黄酮是最强的抗氧化剂之一。且分子较小，水溶性强，易被机体吸收，无蓄积作用，能清除自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，抗细胞凋亡[24]；调节器官组织功能，有效延缓衰老[5]。已有研究发现EGb761能抑制巨噬细胞以及内皮细胞中iNOS基因表达[6]。本研究拟以LPS和PMA诱导体外培养的C6细胞为实验模型，采用激光共聚焦、RTPCR、Western blot 分析 等技术研究EGb761对C6胶质瘤细胞NFκB表达和NO生成的调控。 1 材料和方法 1.1 材料 实验试剂主要有：C6胶质瘤细胞系（中科院上海细胞生物学研究所）；DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone公司）； UNIQ10柱式总RNA提取纯化试剂盒（上海生工公司）；Access QuickTM RTPCR试剂盒（Promega公司）等；EGb761（法国Beaufour Ipsen 制药公司Marie The rses DroyLefaix博士惠赠）。 实验仪器有：CO2培养箱（Napco，USA）；紫外分光光度计（Beckman，USA）；电泳仪（EPS 301，USA）；PCR仪（Eppendorf，Germany）；凝胶成像系统（UVP，USA）；激光共聚焦扫描荧光显微镜（Olympus，Japan）等。 1.2 细胞培养 将复苏的C6胶质瘤细胞混悬于DMEM培养基中（含10%灭活胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素），置37℃、含5% CO2的细胞培养箱内培养，待细胞长成单层后（约3d）按1∶4传代。 1.3 细胞内NO水平检测 将处于对数生长期的C6细胞用0.1%的胰酶消化，用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，配成1×105的细胞悬液，接种于4cm培养皿中，每皿2ml，贴壁2h后换成无血清培养基，分为3组，即对照组、诱导组（LPS 1μg/ml和PMA 400ng/ml）和药物组（在加入LPS和PMA前2h加EGb761 50μg/ml），12h后换成带DAF2DA探针（2.5 μmol/L）的培养基，培养1h，用培养基