华中农业大学病毒学实验技术第六章病毒纯化(XXXX).pptx

第六章 病毒的纯化;一、病毒纯化的标准;二、病毒纯化的理论依据;三、病毒纯化前的预处理 1、病毒感染的组织、脏器或细胞 ;沉淀法 超速离心法 超滤法 层析法 两相溶剂间分配系数法 吸附法 电泳法;（一）沉淀法 主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。 中性盐沉淀法（盐析） 聚乙二醇沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 皂土法 鱼精蛋白沉淀法;1、中性盐沉淀法（盐析） 先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，???复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。 病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。 ;2、聚乙二醇（PEG）沉淀法 用于病毒沉淀的分子量：2000-6000 将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。;3、有机溶剂沉淀法 乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物 原理：A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度降低。 B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。 优点：分辨力高，易除去 缺点：易使表面蛋白质变性，溶解脂质;4、等电点沉淀法（分辨力不高） 原理：病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀（分辨力不高）。 多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。;5、皂土法 轮状病毒 皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病毒，在碱性条件下(pH8.5)，又使其洗脱下来。;6、鱼精蛋白沉淀法（沉淀直径大于50nm的病毒） 鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径大于50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。;（二）层析法 葡聚糖柱层析法 凝胶层析法 离子交换柱层析法 亲和层析法 ;（三）两相溶剂间分配系数法 原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方。 常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds) 聚乙二醇（PEG） 甲基纤维素（MC） 聚乙烯醇（PVA） 分配体系：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系;（四）吸附法 原理：利用对病毒或对杂质有选择吸附能力的固体吸附剂吸附病毒或吸附杂质，再用一定的盐溶液把它们洗脱下来。 作为吸附剂必须具备的特点：;常用吸附剂： 白土 磷酸钙 硅藻土 红细胞 离子交换树脂 羧甲基纤维素;（六）超滤法 利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩。;（七）离心法 差速离心 速度区带离心法 密度梯度离心 ;1.差速离心法 原理：不同大小和比重的粒子沉降速度不同。 用途：从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附释放的病毒悬液中提纯病毒。 优点：可快速处理大量样品 步骤：低速（2000-3000r/min, 20-30min)、中速（10000min, 20-30min)去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。;;速度梯度离心 密度梯度离心;五、病毒纯化应注意的问题;3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适宜的纯化方法。;六、伪狂犬病毒的浓缩提纯 1、病毒材料 将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材料。;2．病毒提纯浓缩 去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min离心30min，收集上清液。 硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃ 5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭菌ddH2O悬浮。 透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次，第5次透析过夜。;浓缩：透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至合适的体积。 超离纯化：;密度梯度离心;浓缩（方法二）;如何利用纯化的病毒进行下一步的研究;病毒纯化;PRV如何侵入细胞;Internalization of IHNV particles through clathrin-mediated endocytosis;9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，