SNT 2125-2008李痘病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2125-2008李痘病毒检疫鉴定方法Identification of Plum pox virus2009-03-16实施2008-09-04 发布中华人民共和国发布o国家质量监督检验检疫总局经技10815套数码防伪 SN/T 2125-—2008前言本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈定虎、王章根、李明福、胡学难、李桂芬、王秀芬、冯黎霞、管维本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2125--2008李痘病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了李痘病毒检疫和鉴定的基本原则和方法。本标准适用于带有李痘病毒的所有进出境的无性繁殖材料、组培苗、种子和果实的检疫鉴定。2原理李痘病毒学名:Plum pox virus(PPV),别名:Sharka virus,是核果类果树危险性最大的病毒之-其外壳蛋白的特异性和核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据;该病毒的分类地位、地理分布、寄主范围和症状、传播途径、血清学特性及基因组特征等参见附录 A。3仪器设备、用具及试剂3.1仪器设备3.1.1酶标检测仪。3.1.2 PCR扩增仪。3.1.3电泳仪。3.1.4台式高速冷冻离心机。3.1.5 凝胶成像系统。3.1.6电子分析天平。3.2　用具3.2. 1 移液器(0.1 μL~2 μL,2 μL～10 μL,10 μL～100 μL,100 μL～1 000 μL)。3.2.2 研钵。3.2.3 0.2 mL、0.5 mL、1.5 mL离心管。3.2.4酶联板。3.3ELISA 检测试剂3.3.1包被缓冲液 1 000 mL(pH9.6)1.59 g碳酸钠(Na²CO3）2.93 g碳酸氢钠（NaHCO:）叠氮化钠（NaN:）0.2 g溶于 1 000 mL蒸馏水中,溶液的 pH 为 9.6,不需要调 pH 值。3. 3.2 PBS 缓冲液 1 000 mL(pH7.2~7. 4)氯化钠(NaCI)8g0.2g磷酸二氢钾（KH,PO）2.9 g磷酸氢二钠(NazHPO4·12H²O)0.2 g氯化钾(KCI)0.2 g叠氮化钠（NaN:）用无菌水溶解并定容至1000 mL。3.3.3样品抽提缓冲液1000 mL2.0g二乙基碳酰二胺(DIECA)20.0 gPVP-10 SN/T 2125—2008用 PBS缓冲液(pH7.2～7.4)溶解并定容至 1 000 mL。3.3. 4洗涤缓冲液1 000 mL吐温-20.0.5 mL500 mLPBS 缓冲液500 mL无菌水叠氮化钠（NaN3）0.2 g3.3.5抗体稀释缓冲液1×PBS缓冲液0.5%牛血清白蛋白(BSA)3.3.6 底物缓冲液(pH9.8)1 000 mL97 mL二乙醇胺800 rhL加蒸馏水0.2g叠氮化钠（NaN）用盐酸(HCI)调pH至9.8,然后定容至1000~mL3.3.7 底物溶液吻对硝基苯磷酸钠（p-Nitrophenyl Phosphate，pNPP），浓度在底物缓冲液中加人碱性磷酸酶的底物为 1 mg/mL.3. 4 PCR 检测试剂3.4.1RNA抽提缓冲液20 mmol/L Tris-HCl,pH 8. l1 mmol/L EDTA,pH 8. 01%SDS,0.2% β-巯基乙醇3.4.2TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.1 mmol/L EDTA,pH 8. 03.4.3TAE缓冲液40 mmol/L Tris-HAc1 mmol/L EDTA,pH 8. 03.4.46×加样缓冲液溴酚蓝0.25%3.4.5引物合成根据已报道的PPV以及其D株系和M株系的保守序列设计通用和特异性引物：PPV通用引物：Primer-1 :5-acc gag acc act aca ctc cc-3Primer-2:5-cag act aca gcc tcg cca ga-3PPV特异性引物：D株系:Primer-1 :5-acc gag acc act aca ctc cc-3PD:5-ctt caa cga cac ccg tac gg-3M株系:Primer-1 :5-acc gag acc act aca ctc cc-3PM:5-ctt caa caa cgc ctg tgc gt-32 SN/T 2125—20084检验方法4. 1 症状检查要仔细检查李属科植物叶片及其花、果实及种子是否有畸形、环斑、斑驳等可疑症状并采集可疑症状的样品。4.2血清学检测对采集的植物样品采用三抗夹心免疫吸附测定