实验六 DNA重组技术.ppt

实验 六 DNA重组技术 1、什么是DNA重组技术？ 重组DNA技术是基因工程的核心技术 重组DNA技术（recombinant DNA technique）又称遗传工程。是在体外重新组合DNA分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。 DNA重组技术发展简史 1973年转基因微生物──转基因大肠杆菌问世； 1980年第一个转基因动物──转基因小鼠诞生； 1983年第一例转基因植物──转基因烟草出现；实现了一种生物的某些性状在另一种生物中的表达。 2、重组DNA操作的一般流程 实验：DNA重组技术之：DNA片段的体外连接 一、实验目的 二、实验原理 三、实验试剂与仪器 四、实验步骤 五、注意事项 一、实验目的 （1）了解和掌握DNA重组技术的基本原理和技术流程。 （2）利用T4DNA连接酶，在体外对来自不同生物的DNA片段进行连接，以构建新的重组DNA分子。 （3）通过本次实验得到重组DNA分子，为重组载体的转化实验提供实验基础材料。 二、实验原理 DNA连接酶（ligase）催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成，利用DNA连接酶可以将适当切割的载体DNA与目的基因DNA进行共价连接。 三、实验试剂与仪器 1）材料 经BamHⅠ和XhoⅠ酶切过的pBI121质粒和加有BamHⅠ和XhoⅠ酶切末端的银杏CHS基因 2）试剂 T4 DNA连接酶（购自：）、配套的buffer、无菌dH2O等 3）仪器耗材 恒温水浴锅、超净工作台、移液器、制冰机、PCR离心管、吸头、一次性手套等 四、实验步骤 1）取1个0.2mL的Eppendorf管中加入2μL酶切后质粒载体DNA和6μL银杏CHS基因片段 2）添加1μL（1/10体积）的10×DNA连接缓冲液以及1μL的T4 DNA连接酶； 反应体系即： 目的基因（CHS） 6μL 酶切质粒 2μL 10×DNA连接缓冲液 1μL T4 DNA连接酶 1μL 总体积 10μL 四、实验步骤 3）混匀后利用离心机瞬间离心将液体全部甩到管底 4）16℃水浴保温过夜 5） -20 ℃保存备用，或利用宿主的感受态细胞进行转化实验（见实验八）。 五、注意事项 1、连接时外源基因量要多些，载体的量要少些，这样碰撞的机会就多些，否则载体自身环化就严重。 2、连接酶的用量不要过多。连接平末端时可适当加大酶量（一般是连接黏性末端时酶量的10~100倍）。 3、连接平末端时注意调节酶量和提高DNA浓度（一般在100~200mg/mL ） 4、连接反应后，反应液在4℃可存数天，-80℃存2个月，但反复冻融会严重降低转化效率。 六、作业 思考并讨论： DNA重组中如何提高DNA的连接效率 * * 实验背景知识 1、什么是DNA重组技术？ 2、重组DNA操作的一般流程 3、DNA重组所需要的基本工具 性状的表达与我们从前学过的什么过程有关？ 与基因控制蛋白质的合成有关! 转 剪 连 连 测 重组DNA操作一般步骤： 1、获得目的基因； 2、与表达载体连接，形成新的重组DNA分子； 3、用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； 4、对转化子筛选和鉴定； 5、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 如何来实现 ：剪切——拼接——导入——表达 呢？ 3、DNA重组所需要的基本工具 （1） 准确切割DNA的工具，“分子剪刀” ── 限制酶； （2） DNA片段的连接工具，“分子缝合针” ── DNA连接酶； （3） 基因转移工具，“分子运输车” ── 载体质粒。 由于质粒载体与外源目的基因被限制性内切酶切割（消化）后末端具有四种形式： 黏性末端 自身不能互补的黏性末端 （用两种以上不同的酶处理） 平末端 （平末端酶处理） 带有相同的黏性末端 （用相同的酶或同尾酶处理） 自身能互补的黏性末端 （仅用一种酶处理） 带有不同的黏性末端 （用不同的酶处理） 对不同末端间连接的方法亦不同： 黏性末端 带有相同的黏性末端 自